DB15T 3451—2024油莎豆根际土壤中假单胞菌分离鉴定技术规程.docx

ICS65.020.01CCSB05

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T3451—2024

油莎豆根际土壤中假单胞菌分离鉴定技术规程

Technicalcodeofpracticeforidentificationofpseudomonasspp.isolatedfromrhizospheresoilofCyperusesculentus

2024-06-14发布2024-07-14实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。

本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC20）归口。

本文件起草单位：内蒙古大学、内蒙古自治区农牧业科学院。

本文件主要起草人：旭日花、张德健、李娟、路战远、叶君、侯智惠、张向前、谢宇、陈文静、李梁、任永峰、赵小庆、陈立宇、王建国、贾赛红、张立华、胡可欣、萨茹拉、韩淑娟、武玲鑫、张宇佳、李子南、韩畅、郭茄。

油莎豆根际土壤中假单胞菌分离鉴定技术规程

1范围

本文件规定了油莎豆根际土壤中假单胞菌的菌株分离、菌株鉴定以及结果判定等技术内容要求。

本文件适用于油莎豆根际土壤中假单胞菌的分离鉴定，也可适用于其它植物根际土壤中假单胞菌的分离鉴定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB8538食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法

SN/T4624.17入境环保用微生物菌剂检测方法第17部分：恶臭假单胞菌

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

根际土rhizospheresoil

受植物根系活动的影响，在物理、化学和生物性质上不同于土体的距离根系表面数毫米的土壤区域。

4菌株分离

4,1培养基配制

首先配制CN培养基，配方及制法依据GB/T6682中的规定执行，实验用水应符合GB8538的规定。按照16g/L明胶蛋白胨、10g/L酸水解酪蛋白、10g/L硫酸钾、1.4g/L氯化镁、0.2g/L溴化十六烷基三甲胺、12g/L琼脂的配方分别称取试剂，加蒸馏水至1L，加入10ml甘油，搅拌均匀，调pH至7.0，煮沸至完全溶解。将配制好的CN培养基121℃灭菌15min，待培养基冷却至50℃~60℃后，依次加入终浓度分别为0.06g/L的青霉素、15mg/L的萘啶酮酸和10mg/L的游霉素（均为市售无菌抗生素，购自酷来博），配制成TSA培养基，倾注到灭菌平板上，培养基厚度至少高5mm，4℃避光保存，保持干燥，在一个月内使用。

4.2根际土样本制备

随机选择健康的油莎豆植株作为根际土取样目标。采样时使用五点取样法采集样品，即现确定对角线的中点作为取样点，而后在对角线上选择与中心点距离相等的点进行取样。采样使用的所有工具和收

集瓶或袋均需无菌。用铲子去除地表植被和其他杂质，使用小锄头轻轻刨开土壤，松动植株细根处区域，连根挖出，抖动去掉散土，用修枝剪剪取细根，每棵植株收集10g根系样品。将收集的样品进行分装并做标记，无菌采样袋密封，并立即放入生物样品采集箱中低温保存（采样箱内提前放入冰袋）。低温运送至实验室。

收集根际土时，在超净工作台内抖落根非根际土，附着在根部约1mm厚的土壤为根际土。将根系样品放入含20ml无菌PBS缓冲液袋无菌离心管中，放置于摇床120rpm/min，室温震荡20min。用无菌镊子剔除根系，剩余悬浮液4℃、6000g离心20min收集根际土壤。直接做后续实验或置于-80℃超低温冰箱保存。

4.3菌株纯化

称取1.5g根际土壤溶于25mlpH7.0的PBS缓冲液（磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶液）中，用无菌吸管吸取25ml该样品溶液置于盛有225ml用无菌生理盐水袋无菌三角瓶中，充分混匀，制成1:10样品匀液。用1ml无菌微量移液器吸取1:10样品匀液，注于盛有9ml无菌生理盐水袋无菌试管中，在振荡器上振荡混匀，制成1:100样品匀液，以此类推，制备1:1000和1:10000样品匀液。选取1:1000或1:10000样品匀液，吸取100μl