(1.7)--工具酶和载体转基因的科学.ppt

BacterialArtificialChromosomes(BACs)basedonbacterialFplasmidBACs-upto300kbusedingenomeprojectsCloningVectors-YeastHybridbacteria/yeastplasmidYACsYeastArtificialChromosomescentromeretelomereyeastreplicationoriginfragmentsof200to1,500kbCloningVectors

-PlantsTiplasmid-AgrobacteriumtransferofT-DNABiBACvectorcombinationofBACandTiplasmidFig6.17ChrispeelsSadava**第八节应用及存在的问题第七节转基因植株鉴定第六节目的基因转化第五节目的基因的获得第四节常用的载体第三节常用的工具酶第二节发展简史与主要研究内容第一节植物基因工程的概念及意义植物基因工程概论第三节常用的工具酶植物基因克隆、DNA生化特性测定、载体构建、基因结构和基因表达调控分析等研究都涉及到工具酶。可以把植物基因工程中使用的酶分为四大类：核酸酶(nucleases)：用于切割或降解核酸分子。连接酶(ligases)：用于把核酸分子连接到一起。聚合酶(polymerases)：用于核酸分子的扩增或复制。修饰酶(modifyingenzymes)：用于给核酸分子添加或减去某些化学基团或核苷酸。这四大类酶大都是从细菌和噬菌体中分离纯化出来的，在细胞中它们原本就参与DNA复制、DNA转录(即RNA合成)、降解外来DNA/RNA、修复突变的DNA分子和不同DNA分子间的重组等一系列重要的生命反应过程。纯化出来以后，它们被人们用来在人工控制条件下（即体外,invitro）完成其在体内催化的反应或是类似的生物学过程，为基因克隆等基因工程服务。绝大多数这类酶促反应是无法用其它化学试剂来替代完成的，这种不可替代性使这些纯化酶类在基因克隆和基因工程中占据了极其重要的地位。一、核酸酶(nucleases)核酸酶是植物基因克隆中使用最普遍的一类酶。它的功能就是打断核苷酸链中的磷酸二酯键，也就是说核酸酶承担的是“切割”核酸的功能。根据其作用底物的不同，可将核酸酶分为二类：核糖核酸酶(ribonucleases)：把RNA分子降解为寡核苷酸。一般用于清除DNA制备物中污染的RNA分子，如RNaseH用于mRNA反转录合成cDNA后，反应体系中mRNA的清除。脱氧核糖核酸酶(deoxyribonucleases):以DNA双链为目标进行降解。根据其降解双链DNA分子方式的不同可分为二类：A.核酸外切酶(exonucleases)B.核酸内切酶(endonucleases)A.核酸外切酶(exonucleases)：从DNA链两端向里切割。依据其切割类型又可分为二种：①从双链DNA分子的一条链的末端开始往里切割；如大肠杆菌外切酶III(E.ColiexonucleaseIII)，它就是从DNA链的3’端向5’端切割，这样，不完全切割的结果导致反应体系中存在带有5’端突出的DNA双链和降解下来的的单链核苷酸。②从双链DNA分子两条链的末端同时往里切割；如Bal31这种酶就是同时作用于DNA分子的两条链，不完全酶切的结果，使反应体系中剩下带平末端的DNA片段和降解下来的单核苷酸，随着酶切时间的延长，该DNA片段就越短。B.核酸内切酶(endonucleases)：从DNA链的内部（而不是从两端）进行切割的核酸酶。可分为两类：①非限制性内切酶(non-restrictionendonuclease)②限制性内切酶(restrictionendonuclease)则与非限制性内切酶相反，它们都能识别一定的DNA序列，在一定的条件下切断DNA链。①非限制性内切酶(non-restrictionendonuclease)：指不识别特定的DNA序列而对DNA分子进行随机切割的内切酶。如从真菌Aspergillusoryzae中纯化出来的S1内切酶，只打断单链DNA中的磷酸二酯键，没有特定的识别序列，因此，S1内切酶