循环免疫复合物的检测.ppt

循环免疫复合物的检测概述免疫复合物：抗原与其相应的抗体结合形成的复合物--组织中固定的免疫复合物（局部免疫复合物）--血液中的循环免疫复合物（circulatingimmunecomplex，CIC）根据形成免疫复合物的Ag-Ab是已知或未知的将CIC分为两大类：--特异性免疫复合物：如HBsAg-抗HBsAg--非特异性免疫复合物循环免疫复合物的检测技术分为抗原特异性和非抗原特异性两类。大多数情况下，免疫复合物抗原性质不清或太复杂了，所以前者不常用；后者检测的是血清中CIC的总量，不考虑形成CIC的抗原特异性。类别原理方法敏感性备注物理法分子大小1.超速离心－适于研究2.分子超滤－适于研究3.凝胶过滤30μg适于研究溶解度1.PEG沉淀20μg粗定量,易推广2.冷沉淀－定性,临床应用补体法固定补体,结合C1q抗补体试验0.1μg常用,特异性差1.C1q凝胶沉淀试验100μg定性,不易普及2.C1q偏离试验4μg不易普及3.液相法10μg不易普及4.固相法1μg不易普及胶固素胶固素结合试验3μg敏感,稳定抗Ig法结合RF1.RF凝胶沉淀试验100G定性,不敏感2.mRF固相抑制试验1～20μg不易普及3.PRF凝集抑制试验1～10μg不易普及结合Ig抗抗体法2～3μg不易普及细胞法Fc受体1.血小板凝集试验1～4μg需新鲜制备2.ADCC抑制试验5～10μg细胞活性质控难3.Mφ吞噬抑制试验0.03μg细胞活性质控难补体受体1.Raji细胞法6μg需维持细胞株2.花环抑制试验10μg影响因素多CIC的检测方法实验目的本次实验采用聚乙二醇（PEG）沉淀法检测CIC，以此进一步理解CIC检测的基本原理，并熟悉其操作过程和临床意义。实验原理PEG是非离子型水溶性聚合物，有很强的亲水性，可以破坏溶液中蛋白质表面的水化层，使蛋白质沉淀，即使浓度很高也不会引起蛋白质变性。不同浓度的PEG能选择性沉淀不同的蛋白质。用终浓度为30～40g/L的PEG6000能选择性沉淀CIC。循环免疫复合物与聚乙二醇作用，以浊度变化表现出来，可根据浊度的大小来反映免疫复合物的多少，浊度的大小用分光光度计测定。实验材料试剂：0.1mol/LpH8.4硼酸缓冲液（BBS）、41g/LPEG溶液器材：722分光光度计、0.5cm比色杯、试管标本：待测血清（已1:3稀释）实验步骤按照下表加样，此时PEG最终浓度为37.3g/L。加样后，充分混匀，置4℃1h，置室温10min。用分光光度计在波长495nm下测两管的A值，以BBS调零。实验结果记录对照管和测定管的A值待测血清A值＝测定管A值－对照管A值正常血清CIC的A值为0.043±0.02（X±SD）。大于正常人A值两个标准差或更高者为CIC阳性。注意事项不同浓度的PEG可沉淀不同分子量的免疫复合物。20g/LPEG可沉淀较大的CIC，40g/LPEG则沉淀较小的CIC，但浓度大于50g/LPEG选择性沉淀CIC的特性即消失，可能导致假阳性。温度变化对结果影响较大。4℃时CIC沉淀最佳，室温每升高1℃，A值下降0.2。低密度脂蛋白、高γ球蛋白血症或脂肪含量过高均可使浊度增加，故应空腹采血。样本陈旧或反复冻融等均可影响检测结果，故待测血清一定要新鲜，防止血清污染及聚合IgG形成。通常4℃冰箱保存不能超过3天，-20℃保存时间可适当延长。临床应用CIC的检测对免疫复合物病（如血清病、SLE）是一种辅助诊断指标，对判断疾病活动和疗效有一定意义。PEG比浊法检测CIC快速、简便，敏感度达20mg/L，但不能区分免疫复合物的大小，且重复性和特异性较差，一般可以用于CIC的筛选。CIC检测方法较多，但实际工作中尚未建立公认有效的单一方法，且没有理想的标准品用于定量试验，最好采用多种方法同时进行，以增加结果的可靠性。*CIC是指在体液中游离的抗原-抗体复合物，分子量约为1000kD*循环免疫复合物的测定虽无特异性诊断意义，但对病情的活动性判断和指导治疗有一定价值***书本p363,热凝聚IgG（凝聚IgG在理化形状和免疫学活性等方面均与免疫复合物相似，是国际公认的循环免疫复合物检测的标准品。）PEG比浊法操作简便，测定快速，易于推广，但不能区分免疫复合物的大小，干扰因素多，特异性较差，用于CIC的粗筛目前检测免疫复