黄尾鰤腹水病毒的快速检测试剂盒及其检测方法.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局

(12)发明专利说明书

(10)申请公布号CN101445836A

(43)申请公布日2009.06.03

(21)申请号CN200810160608.5

(22)申请日2008.11.19

(71)申请人山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

地址266002山东省青岛市瞿塘峡路70号

(72)发明人岳志芹刘荭史秀杰贾俊涛梁成珠李琼凌宗帅郑小龙邓明俊肖西志赵巍

孙涛

(74)专利代理机构青岛海昊知识产权事务所有限公司

代理人张中南

(51)Int.CI

C12Q1/70

C12Q1/68

权利要求说明书说明书幅图

(54)发明名称

黄尾鰤腹水病毒的快速检测试剂盒

及其检测方法

(57)摘要

本发明公开一种黄尾鰤腹水病毒的

快速检测试剂盒及其检测方法。本发明包

括由BstDNA聚合酶、逆转录酶、反应缓

冲液、环介导等温扩增混合液、引物混合

液和荧光显色剂共6种试剂组成的试剂

盒，以及使用该试剂盒检测鱼类样品中黄

尾鰤腹水病毒的一套检测操作程序，以实

现对黄尾鰤腹水病毒快速检测的标准化，

为鱼类的健康养殖和国际鱼类贸易的发展

提供科学依据。本发明具有特异性好、灵

敏度高、操作简便、高效等优点，可广泛

的应用于水产养殖场以及进出口鱼类贸易

中的现场即时检测，并可以为相关基础研

究提供技术支持，具有广泛应用前景。

法律状态

法律状态公告日法律状态信息法律状态

权利要求说明书

1.一种黄尾鰤腹水病毒的快速检测试剂盒，其特征在于试剂盒中包括试剂A-F：

试剂A：BstDNA聚合酶，8U/μL；

试剂B：逆转录酶，200U/μL；

试剂C：反应缓冲液，其中含有200mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、

100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、80mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；

试剂D：环介导等温扩增混合液，其中含有4.0μL2.5mmol/LdNTP、2.0μL10mol/L

甜菜碱、0.5μL200U/μLRNA酶抑制剂和5-6μL分子生物学级超纯水；

试剂E：引物混合液，其中含有2μL20μmol/L正向内引物、2μL20μmol/L反向内

引物、1μL5μmol/L正向外引物、1μL5μmol/L反向外引物和1μL20μmol/L反向环

引物；其中引物序列分别如下：

正向内引物：5′-

CGCCATGGGGAAGAGTGTTGATTTTCATTGTGAGAGGCATCCGG-3′；

反向内引物：5′-AGCCGCCGACCAATTCATCGTTTTGTCCTCCTGCTGCATGTG-

3′；

正向外引物：5′-TCCCAACCTCTCAAGCCT-3′；

反向外引物：5′-CTGGCCCAGGAGTCCATT-3′；

反向环引物：5′-AGACCTGACCAAGACCAACG-3′。

试剂F：荧光显色剂，成分为100×的荧光染料SYBRGREENI。

2.利用权利要求1中所述的快速检测试剂盒进行黄尾鰤腹水病毒的检测方法，其特

征在于检测程序如下：

(1)待检样品的RNA的提取：

提取待检样品的RNA，保证RNA的ODsub260/sub/ODsub280/sub在1.8-

2.0范围内，调整浓度在100-200ng/μL之间；

(2)进行黄尾鰤腹水病毒的环介导等温扩增反应：

首先取一个0.2mL的聚丙烯塑料管，加入1-2μL的步骤(1)提取的待测样品的RNA，

再加入1μL试剂A，1μL试剂B，2.5μL试剂C，11.5-12.5μL试剂D和7μL试剂E，

使得反应总体积为25μL。然后将上述塑料管置于60-65℃的恒温水浴锅中，放置

40-60mi