遗传的物质基础.ppt

六、DNA的变性和复性变性：热，试剂，氢键、碱基堆积力破坏，DNA由双链变成单链温度：80～100℃变性剂：尿素，甲酰胺增色效应（hyperchromicity）正常双链（50μg/ml）A260=1.00完全变性的单链DNAA260=1.37单核苷酸A260=1.60DNA双螺旋结构失去一半时，A260=1.185第31页,共54页，星期六，2024年，5月Tm值的影响因素：DNA的均一性均一性高，Tm值的范围小G-C含量G-C含量高，Tm值高经验公式G-C%=(Tm-69.3)×2.44介质中的离子强度低离子强度易熔解变性DNA保存在高浓度缓冲液中防变性（TE）第32页,共54页，星期六，2024年，5月复性单链重新缔合为双螺旋的过程，一般比Tm低20～25℃下进行复性过程：复性时溶液中单链DNA随机碰撞。GC先配对形成短的双链，然后配对区域延伸，象拉链一样复性产生的不一定是原有的互补链，非原配第33页,共54页，星期六，2024年，5月影响DNA复性的因素：DNA复杂性简单序列复性快DNA浓度高浓度复性快DNA片断片断小复性快，移动碰撞机会多温度过低温度减少互补链的碰撞机会盐浓度过低盐浓度使复性后的DNA又变性第34页,共54页，星期六，2024年，5月杂交：不同来源的单链核酸经碱基互补配对而形成的双螺旋，DNA-DNA,DNA-RNADNA杂交可反映不同生物中DNA的共同序列和不同序列，研究生物的进化，核酸杂交是现代分子生物学的基础第35页,共54页，星期六，2024年，5月液相杂交第36页,共54页，星期六，2024年，5月滤膜杂交第37页,共54页，星期六，2024年，5月Cot曲线DNA复性时的单链消失的速度1C/Co=――――1+KCotC：单链DNA浓度，Co：DNA总浓度，t：时间秒，k：=二级反应常数复性的分数C/Co是起始浓度和经过时间的乘积（Cot）的函数。第38页,共54页，星期六，2024年，5月Cot曲线第39页,共54页，星期六，2024年，5月定义C/Co=1/2时，Cot值定义为Cot1/2；即复性一半时DNA总浓度和时间乘积11/2=――――――1+Kcot1/21+KCot1/2=2Cot1/2=1/k不同DNA的Cot1/2值不同，总DNA浓度相同时，片断越短，Cot1/2值越小，DNA复杂性越高，复性越慢，基因组大复性慢.第40页,共54页，星期六，2024年，5月第41页,共54页，星期六，2024年，5月DNA复杂性（X）：最长的没有重复序列的DNA核苷酸对的数值：ATATAT---,X=2ATGC------,X=4X=KCot1/2第42页,共54页，星期六，2024年，5月七、DNA超螺旋结构生物体中大多数DNA是以超螺旋的形成存在，而缺少超螺旋的DNA则为松弛型DNA原核生物DNA，共价封闭环，再经螺旋就成为超螺旋真核生物DNA为线性，DNA与蛋白质结合之间的DNA可形成一个小“环”，类似共价封闭环，从而螺旋成为超螺旋第43页,共54页，星期六，2024年，5月第44页,共54页，星期六，2024年，5月正超螺旋：和DNA内部双螺旋缠绕方向相同的方向缠绕形成的超螺旋，结构更加紧密。DNA每圈初级螺旋的碱基对小于10.5，则为正超螺旋。第45页,共54页，星期六，2024年，5月负超螺旋：DNA绕其轴与右手双螺旋方向相反的方向缠绕所产生的超螺旋，结果减少每个碱基对的旋转，每圈初级螺旋的碱基对大于10.5，则为负超螺旋。超螺旋是耗能过程，超螺旋的产生可能为能量的储存形式第46页,共54页，星期六，2024年，5月拓扑异构酶Ⅰ催化DNA链断裂和重新连接。每次只作用于一条单链，无需ATP，功能是松弛DNA，代表：E.coli拓扑异构酶Ⅰ，对单链DNA的亲和力比双链高，能识别负超螺旋区，使负