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土壤微生物胞外酶活性测定荧光法

1范围

本文件描述了土壤微生物胞外酶活性利用微孔荧光法的测定方法。

本文件适用于使用微孔荧光法检测土壤中与碳、氮、磷循环相关的关键水解酶活性，且酶底物荧光

指示剂需是4-甲基伞形酮或7-氨基-4-甲基香豆素。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

CB/T603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备

GB7172土壤水分测定法

GB/T32722土壤质量土壤样品长期和短期保存指南

GB/T36197土壤质量土壤采样技术指南

HJ613土壤干物质和水分的测定重量法

T/GSSF004土壤样品采集、制备及保存技术规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

β-1.4-葡萄糖苷酶β-1.4-Glucosidase：BG

是一种碳降解酶，在碳循环过程中降解β-1.4-葡聚糖和纤维素，将纤维二糖水解为葡萄糖。

3.2

β-木糖苷酶β-Xylosidase：XYL

是一种碳降解酶，碳循环过程中水解低聚木糖生成木糖。

3.3

纤维二糖葡萄糖苷酶B-D-cellobioside：CBH

是一种碳降解酶，碳循环过程中从纤维素分子的非还原端水解纤维二糖二聚体。

3.4

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶β-N-acetylglucosaminidase：NAG

是一种氮降解酶，氮循环过程中在几丁质和其他β-1.4-连接的氨基葡萄糖聚合物的降解中发挥作

用。

3.5

亮氨酸氨基肽酶Leucineaminopeptidase：LAP

是一种氮降解酶，氮循环过程中从多肽的N端水解亮氨酸和其他疏水性氨基酸。

3.6

磷酸酶Acidphosphatase：PHOS

是一种磷降解酶，磷循环过程中水解磷酸单酯或磷酸二酯，释放出磷酸。

3.7

4-甲基伞形酮4-Methylumbelliferone：MUB

是一种水溶性的强荧光染料，在测定过程中，通过酶的催化作用，标记有伞形酮的底物发生分子内

消除反应，导致伞形酮脱落，形成与原底物具有不同的光学特征的产物。目前广泛使用的底物有4-甲基

伞型酮β-1.4-葡萄糖苷(4-MUB-β-D-glucoside)、4-甲基伞型酮β-木糖苷（4-MUB-β-Xylosidase）、

1

4-甲基伞型酮纤维二糖苷(4-MUB-β-D-cellobioside)、4-甲基伞形酮乙酰氨基葡萄糖苷(4-MUB-β

-N-acetylglucosaminidase)、4-甲基伞形酮磷酸酯(4-MUB-Phosphate)，分别是β-1.4-葡萄糖苷酶、

β-木糖苷酶、纤维二糖葡萄糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、亮氨酸氨基肽酶、磷酸酶的荧光指示

剂。

3.8

7-氨基-4-甲基香豆素7-Amino-4-methylcoumarin：AMC

是一种水溶性的强荧光染料，是亮氨酸氨基肽酶底物特有的荧光指示剂。

4原理

荧光酶测定使用来自底物荧光的差异来测量酶反应。荧光是当吸收不同波长的光后分子发出一个波

长的光，其与特定底物结合时荧光特性消失，当酶分解其特异性底物时，通过酶的水解作用，底物中包

含的荧光物质MUB或AMC被释放出来，由于MUB和AMC在365 nm波长处激发，在450 nm处检测到荧光，进而

设定365 nm激发波长和450 nm检测波长，通过检测其荧光量来表征酶活性。

5土壤采集和试剂配制

5.1土壤样品采集及保存

5.1.1样品采集

土壤样品采集应符合GB/T36197和T/GSSF004的规定。

5.1.2样品保存

采集的样品按照GB/T32722和T/GSSF004的规定4℃储存，7天之内测定。

5.2试剂配制

试剂应按照GB/T603的规定进行制备。

5.2.1标准物

——标准物1：MUB

称取17.5 mgMUB溶于80 mL无菌去离子水中，将其转移至100 mL棕色容量瓶，用无菌去离子水定