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华中农业大学动物科技动物医学院

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HE染色与免疫组织化学染色实验报告

1实验目的及意义

了解石蜡切片的制作过程

1.2掌握HE染色与免疫组织化学染色的基本原理以及染色方法

1.3熟悉HE染色与免疫组织化学染色后的读片知识

2实验方法及步骤

石蜡切片制作及HE染色步骤

2.1.1取材与固定：

从人或动物新鲜尸体上取下组织块（一般厚度不超过0.5厘米）投入预先配好的固定液中（10%福尔马林）使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。

2.1.2脱水透明：

一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。

2.1.3浸蜡包埋：

将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器（如折叠一小纸盒），倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。

2.1.4切片前的准备工作：

先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm勺石蜡块，块两边必须切成平行的直线。将玻片擦洗干净后均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油，放置冰箱备用。

2.1.5切片与贴片：

将预冷的蜡块固定于切片机上，调节切片厚度为6微米，切成薄片。切下的薄片往往皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放 45°C恒温箱中烘干。

2.1.6脱蜡至水

二甲苯I20分钟，二甲苯U20分钟，无水乙醇3分钟，95%酒精3分钟，80%酒精3分钟，70%酒精3分钟，自来水洗5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.1.7染色：

苏木素液7分钟，自来水洗5分钟，1%盐酸溶液分化30秒，自来水洗5分钟，1%氨水返蓝10秒，自来水洗20分钟，95%酒精3分钟，1%伊红酒精溶液2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.1.8脱水和透明：

95%酒精2分钟，无水酒精I2分钟，无水酒精U2分钟，二甲苯I5分钟，二甲苯U5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.1.9封固：

将已透明的切片滴上中性树胶，盖上盖玻片封固，放入 37C烘箱。

2.2SABC染色步骤

2.2.1脱蜡至水：

二甲苯I20分钟，二甲苯U15分钟，100%酒精2分钟，95%酒精2分钟，80%酒精2分钟，70%酒精2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。2.2.2流水冲洗5分钟（水流要小）

2.2.3用蒸馏水配置新鲜的3%双氧水（30%双氧水1：9配制，配100ml），室温封闭15分钟，注意避光。

2.2.4蒸馏水洗5分钟，重复2次。

2.2.5热抗原修复，将切片浸入0.01M枸盐酸盐缓冲液中，置微波炉内高火5分钟，低火20分钟，完后自然冷却。

2.2.6取出切片放入染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。

2.2.7取出切片放入湿盒中，滴加5%BSA寸闭液（覆盖满组织为宜），室温20分钟。

2.2.8甩去多余液体（擦去周围的流痕），滴加一抗（覆盖满组织为宜）注：阴性对照滴加PBS放入4C冰箱过夜。

2.2.9放入染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。

2.2.10取出放入湿盒中滴加二抗（覆盖满组织为宜），室温30分钟。

2.2.11取出置染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。放回湿盒中加SABC（覆盖满组织为宜），室温30分钟。

2212取出置染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。

2213DAB显色，取一试管加1ml单蒸水，B、C、A试剂按顺序各一滴加入试管中混匀，滴加于切片上，观察是否终止显色。

2.2.14终止显色用单蒸水洗5分钟，重复2次。

2.2.15苏木素衬染1分钟，流水冲洗5分钟。

2.2.16脱水透明，70%酒精3分钟，80%酒精2分钟，90%酒精2分钟，95%酒精2分钟，95%酒精U2分钟，100%酒精I2分钟，100%酒精U2分钟，100%酒精川2分钟二甲苯I8分钟，二甲苯U5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.2.17中性树胶封片，放入37E烘箱。

3实验结果

3.1HE染色结果

IB:狂犬病毒包涵体（内基氏（Negri）小体）

图1狂犬病毒感染后脑组织病变 HE染色

A: 小脑浦肯野细胞内包涵体x400;B:脑神经元内多处包涵体x400

狂犬病的病理变化在显微镜下主要表现为神经元退变，淋巴细胞和单核细