2021高中生物竞赛—细胞生物学基础02细胞生物学研究方法课件.pptVIP

三、显微光谱分析技术细胞中有些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线，如核酸的吸收波长260nm，蛋白质280nm。有些成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。根据细胞成分所具有的这种特性，可利用细胞分光光度计对一定的成分进行定位、定性，甚至定量测定。四、流式细胞术*仪器：流式细胞计—flowcytometer*特点：细胞是高速运动的*主要应用：用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量；测定细胞群体中不同时相细胞的数量；从细胞群体中分离某些特异染色的细胞。二、流式细胞术用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一门技术。原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测，转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果，并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所用仪器称为流式细胞计（flowcytometer）。五、放射自显影（radioautography)放射自显影技术：利用放射性物质使照相乳胶膜感光，再经显影以显示该物质自身的存在部位的技术。由于有机大分子均含有碳、氢原子，实验室一般采用14C、3H标记。14C、3H均为弱β放射性同位素，半衰期长。14C半衰期为5730年，3H为12.5年一般常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷来显示DNA，用3H尿嘧啶核苷显示RNA。在研究蛋白质和粘多糖时，分别选用3H氨基酸、3H甘露糖、3H岩藻糖等。3H-尿嘧啶脉冲标记的细胞，示异染色质区（核内白色区）无转录活性五、超离心技术高速离心：10000—25000r/min超速离心：转速大于25000r/min沉降系数（“S”—Svedbergunit）:单位离心场中溶质分子的沉降速度1S相当于1?10-13s离心目的：分离细胞器与生物大分子及其复合物大多数蛋白质和核酸的沉降系数在4S和40S之间，核糖体及其亚基在30S和80S之间，多核糖体在100S以上。离心种类：分析离心：用于分析和测定制剂中的大分子的种类和性质等制备离心：差速离心：分离密度不同的细胞组分密度梯度离心：精细组分或生物大分子的分离（介质蔗糖、氯化铯）微粒体(microsomes)在超离心时，分离出的小泡状成分，系由内质网等膜的碎片组成，小泡的外表面常附有核糖体，是研究糙面内质网功能活动的良好材料。（二）密度梯度离心用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞分层、分离。类型：速度沉降、等密度沉降。常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；2）PH中性或易调为中性；3）浓度大时渗透压不大；4）对细胞无毒。1、速度沉降velocitysedimentation用途：分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。特点：介质密度较低，介质的最大密度应小于被分离生物颗粒的最小密度。原理：介质密度梯度平缓，分离物按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。2.等密度沉降isopycnicsedimentation用途：分离密度不等的颗粒。特点：介质密度较高，陡度大，介质的最高密度应大于被分离组分的最大密度。所需的力场通常比速率沉降法大10~100倍，往往需要高速或超速离心。原理：样品各成分在连续梯度的介质中经过一定时间的离心则沉降到与自身密度相等的介质处，并停留在那里达到平衡，从而将不同密度的成分分离。（一）差速离心Differentialcentrifugation特点：介质密度均一；速度由低向高，逐级离心。用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。六、分子杂交技术（molecularhybridization)原理：具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA,DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。方法：原位杂交体外分析核酸的主要方法★Southernblotting又称DNA印迹法Northernblotting又称RNA印迹法原位杂交（insituhybridization)：在不破坏细胞或细胞器的情况下，用核酸探针检测特定核苷酸序列在染色体上的精确位置的技术。染色体在高pH值条件下，DNA解链，带标记的核