包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴.docx

包涵体蛋白的纯化及复性争论专贴！

zbbnetwrote:

最近试验遇到了大麻烦，说出来大伙帮助想想法。

试验所用菌株为BL21，载体pMAL-p2X，与MBP融合表达，目的蛋白有三对二硫键。最初的设计思想是想通过MBP的信号肽实现可分泌表达，但试验觉察主要是包涵体表达。菌体超声裂开后12023rpm离心，所获得的沉淀不能很好的贴在离心管底，而是处于局部溶解状态，对沉淀再作如下处理：

1、2M尿素洗涤，pH8.5，12023rpm离心，获得的上清不是澄清透亮而是略显混浊，这

次的沉淀能够结实的贴在管底。

2、4M尿素洗涤，pH9.0，12023rpm离心，获得的上清不是澄清透亮而是略显混浊，这

次的沉淀为半溶状态的冻状物。

3、8M尿素溶解上述2中的沉淀，几乎不见不溶的颗粒，但溶液还是略显混浊。上述三溶液取样电泳，均见较多的目的蛋白。

对3中的溶液取样调pH至12溶液照旧混浊。

0.22um过滤，无法去除混浊物。

考虑到混浊物是多聚体，样品中参加1％SDS和0.2％β-Me，都无法改善。

做上述处理，主要考虑到混浊物是目的蛋白，由于目的蛋白设计了6HIS但不能成功的结合Ni柱。

主要想请教这样几个问题：

1、有没有那位战友也碰上我上述的问题，这种问题是如何解决的？

2、我所描述的包涵体的状态说明白什么问题？

3、对与蛋白溶液混浊有什么好的处理方法？暂不争论分泌表达的问题。

答复：

你的状况很正常，依据三次沉淀处理状况，应当可以确定你的蛋白在8M

Urea中是完全可以裂解的。并且该蛋白如假设作复性应当可溶性较佳。但依据我个人的阅历。假设MBP融合蛋白还是以包含体表达的话是很没有意思的，建议作单独表达，除非单独表达不行。否则即使完全复性，目的蛋白活性也大打折扣。另可优化表达条件，有可能可容表达的，不要放弃，你的破菌上清也可以跑胶看看有没有目的蛋白。

说明蛋白蔬水性不强。

3。有些蛋白裂解后有浑浊格外正常，尤其是MBP融合的，即使做到可容也会有白乎乎浑浊的现象，只要不影响使用就行，没必要在意。

各位高手：

我原来在25-27度表达出可溶性蛋白，现在23、25、27度均是包涵体。现在，急着纯化，用包涵体〔GST融合蛋白〕复性纯化可以吗？怎样做？怎样保持目的蛋白的活性？

恳请赐教，先感谢了！！！

jingluowrote:

透析液总体积的50％？是不是在透析完毕后往蛋白溶液里加甘油？

不，是直接加在透析液里面。wrote:

不，是直接加在透析液里面。

加这么多的甘油，我担忧对PH的调配会不会有影响？

lmj2023wrote:

各位高手：

我原来在25-27度表达出可溶性蛋白，现在23、25、27度均是包涵体。现在，急着纯化，用包涵体〔GST融合蛋白〕复性纯化可以吗？怎样做？怎样保持目的蛋白的活性？

恳请赐教，先感谢了！！！

你这个问题好难答复，牵涉的问题太多。

建议你还是找找缘由解决蛋白不行容表达的问题。

由于假设你真的要做复性，那首先必需将GST融合蛋白复性好了，该蛋白才能挂柱纯化，但即使如此也不能保证你的目的蛋白能复性好。何况一般状况下复性效率都很低，不超过30%

依据我的阅历，假设蛋白GST融合后还包含体表达就一点意义都没有。所以还是回去解决可容性的问题，这样比把大量时间花在复性上有意义的多。

jingluowrote:

加这么多的甘油，我担忧对PH的调配会不会有影响？

不要紧，加完甘油后再调PH值，没问题的，我们始终这么做，呵呵。wrote:

不要紧，加完甘油后再调PH值，没问题的，我们始终这么做，呵呵。

好的，我明天试试。

erwinchenwrote:

你这个问题好难答复，牵涉的问题太多。

建议你还是找找缘由解决蛋白不行容表达的问题。

由于假设你真的要做复性，那首先必需将GST融合蛋白复性好了，该蛋白才能挂柱纯化，但即使如此也不能保证你的目的蛋白能复性好。何况一般状况下复性效率都很低，不超过

30%

依据我的阅历，假设蛋白GST融合后还包含体表达就一点意义都没有。所以还是回去解决可容性的问题，这样比把大量时间花在复性上有意义的多。

感谢了，那我就连续找可容性表达的方法了！

请教大家

我用PQE载体构建的重组体转化了BL-21，已诱导出目的蛋白。打算用该蛋白建立ELISA

法检测人群中的抗体。

下面打算纯化目的蛋白，已经购置了申能博彩的BBSTNTAResin

依据说明书的变性条件下从包涵体中纯化HisTag蛋白质方法纯化蛋白。我的问题是依据我的试验目的，用该树脂纯化之后是否需要进展蛋白复性？复性的方法是否就是用不同浓度梯度的尿素进