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一、生命大分子制备
1、生物大分子的特性:
(1)由结构比较简朴的小分子所组成
(2)具有非常复杂的结构
2、生物大分子制备难度:
(1)生物材料的组成极其复杂
(2)许多生物大分子在生物材料中的含量极微,分离纯化的环节繁多,流程又长
(3)许多生物大分子极易失活,所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件
(4)溶液的温度、PH值、离子强度等各种参数综合影响溶液中生物大分子的制备,很难准确估计和判断,个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。
3、生物大分子制备的通常环节:
(1)拟定要制备的生物大分子的目的和规定
(2)建立相应的可靠的分析测定方法
(3)通过文献调研和预备性实验,掌握生物大分子的物理化学性质
(4)生物材料的破碎和预解决
(5)分离纯化方案的选择和探索
(6)生物大分子制备物的纯度的鉴定。规定达成一维电泳一条带,二维电泳一个点,或HPLC和毛细管电泳都是一个峰
(7)产物的浓缩,干燥和保存
4、蛋白质的分离纯化:
(1)材料获得:天然获得;基因工程手段获得
(2)粗分离:除去大量杂质和杂蛋白,初步浓缩目的蛋白
(3)细分离:常压柱层析:分子筛层析、离子互换层析、疏水层析、亲和层析
(4)鉴定:纯度、浓度、活性
5、蛋白质的结构研究:
(1)一级结构:氨基酸组成分析、末端分析、肽谱分析
(2)二级结构:紫外光谱法、荧光光谱法、园二色性法、红外光谱法、激光拉曼光谱法
(3)高级结构:X-射线衍射法、核磁共振法
(4)结构与功能的关系:突变、晶体分析、蛋白与蛋白的互相作用
6、酶活力:酶催化一定化学反映的能力。
7、酶活力单位:每分钟催化生成一微摩尔产生所需要的酶量为一个酶活力单位。
8、制备生物大分子的方法:
(1)以分子大小和形态的差异为依据的方法:差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等
(2)以溶解度的差异为依据的方法:盐析。萃取、分派层析、选择性沉淀和结晶等
(3)以电荷差异为依据的方法:电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子互换层析等
(4)以生物学功能专一性为依据的方法:亲和层析等
9、酶的比活力:每毫克酶蛋白所具有的酶活力单位娄,是酶制剂纯度的一个指标
10、回收率:纯化过程中酶活性的收率
11、纯化位数:指提纯后与提纯前酶比活力的比值
增大纯化位数和缓慢减少回收率的方法属于有应用价值的方法。
12、蛋白质的鉴定:
(1)浓度:紫外法、Lowry法、Bradford法、凯氏定氮法、双缩脲法
(2)纯度:电泳法、化学法、仪器法
(3)分子量测定:SDS、凝胶过滤、氨基酸组成分析、毛细管电泳
(4)等电点:等电聚焦电泳
(5)活性:激酶、磷酸化酶、运用靶酶活性、氧化还原酶、ELISA。
二、沉淀法
1、沉淀法:
纯化大分子物质的一种经典方法。
操作简朴,成本低廉。不仅用于实验室中,也用于某些生产目的的制备过程,是分离纯化生物大分子,特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程,可以有选择性的沉淀杂质或有效成分。
原理:不同物质在溶剂中的溶解度不同而达成分离的目的(又称溶解度法)
改变溶液的某些性质(如pH、极性、离子强度、金属离子等),使抽提液中各种物质的溶解度发生变化。选择适当的溶液就能使欲分离的有效成分呈现最大溶解度,而使杂质呈现最小溶解度,或者相反,有效成分呈现最小溶解度,而杂质呈现最大溶解度。然后通过适当解决,即可达成从抽提液中分离有效成分的目的。
2、沉淀可以分为可逆性沉淀和不可逆性沉淀
可逆性沉淀:在沉淀过程中,有效成分结构和性质都没发生变化,在适当的条件下,可以重新溶解形成溶液。可逆沉淀是分离和纯化有效成分的基本方法,如等电点沉淀法、盐析法、有机溶剂沉淀法、选择性沉淀法。
不可逆沉淀:在强烈沉淀条件下,不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性,并且也破坏了蛋白质的结构和性质,产生的蛋白质沉淀物不也许再重新溶解于水溶液。加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀、生物碱沉淀。(沉淀物一般是杂质)
3、常用的沉淀方法和沉淀剂:
(1)盐析法:选用中性盐为沉淀剂,多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
(2)有机溶剂沉淀法:多用于生物小分子,多糖及核酸类产品的分离纯化,有时也用于蛋白质沉淀。
(3)等电点沉淀法:用于氨基酸,蛋白质及其他两性物质的沉淀,但单独应用较少,多与其他方法结合使用。
4、制备蛋白质:
(1)盐析法:
在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。
1-1.优点:①成本低,不需要特别昂贵的设备。
②操作简朴、安全。
③对许多生物活性物质具有稳定作用。
在纯水中加入少量中性盐,蛋白质的溶解度比在纯水时大大增长,称为“盐溶”现象。
但中性盐的浓度增长至一定期,蛋白质的溶解度又逐渐下降,直至沉淀析出,称为“盐析”现象。
由于中性盐的亲水
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