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RT-PCR实验

时间:2013-01-0522:32来源:作者:生物界

RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。

要求：

1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng

或1ug。

2.RT按要求做，一般不会出太大问题。

3.PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA

存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。

1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须

在RT时，引物设计有3种方法即a：Random9mers；b：OligodT-AdaptorPrimer；

和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），

还要用此产物做PCR的模板继续扩增。

如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？

问题：

在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一

种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却

得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其

解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出

来）

从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不

会和这有关呢？请高手指教！

解答：

1.RT-PCR有两种做法：

条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录

再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推

测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。

（promega）。

2.RT-PCR应具备的条件

高质量的RNA（保留后可做5‘，3’RACE）；引物的（最好产物短点）；若涉及粗

略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我

发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系

的均一性等。

3.RACE

我做过RACE（3’RACE是宝生物的Kit；5‘RACE是Gibico），但现在再进行另

一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增

出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3’UTR

却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故，我都快绿了，

有无

RT-PCR的常用内标b－actin和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不

同的刺激。

有关内参：

RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把

除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基

因表达的相对浓度。

问：我曾经作过同一管的PCR，内有actin和目的基因引物。虽然可见到两条均

一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。请教mxbdna2003，你是如

何处理同一管的PCR的各成分的浓度？

答：itshoulddeterminedtheamountofRNA.butitnotforthequantitity

ofthePCR.itjustwasconvienenttoguesstheamountotthetemplate(for

RTandPCR)andbettrerforpublicationandeditorifhedonnotknowthe

preoceduremuch.buttheamountjustusingaccuratepiptteiswrong.

itshoudberememberedtodotheinnercontrolofhousekeepinggene

everytime.

在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量

的^-^，（平时做pcr的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两就可以了，

我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg就跟不能变了，一变整个体系就变

了。能看到均一条带就很好了。

关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开