课件：实验四-叶绿素提取、理化性质及含量测定.pptVIP

实验四叶绿体色素的提取、理化性质与含量测定

提取叶绿体色素分析叶绿体色素的物理、化学性质测定叶绿素含量提取和测定植物组织中的光合色素是研究光合作用机理的重要技术手段。1.实验目的及意义2.1用含水的有机溶剂提取叶绿素2.实验原理亲水的“头部”：镁原子居于卟啉环的中央，带正电性，与其相联的氮原子则偏向于带负电性，因而卟啉具有极性，是亲水的，可以与蛋白质结合。亲脂的“尾巴”：叶绿醇是由四个异戊二烯单位组成的双萜，是一个亲脂的脂肪链，它决定了叶绿素的脂溶性。纯的有机溶剂不能打破叶绿体色素与蛋白质的联系，所以必须用能与水混溶的有机溶剂并有少量水存在时，才能将叶绿体色素提取出来。80%丙酮95%乙醇丙酮:乙醇:水(4.5:4.5:1)2.2叶绿素的物理性质1）叶绿素的吸收光谱红光区：640~660nm篮紫光区：430~450nm胡萝卜素和叶黄素：400~500nm不用蓝光区测叶绿素含量。2）荧光现象叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色的现象。2.3叶绿素的化学性质叶绿素是叶绿酸的酯（叶绿酸是双羧酸，其中一个羧基被甲醇酯化，另一个被叶绿醇酯化）。叶绿素可以与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。1）皂化反应皂化分层叶绿酸的盐形成以后，因分子极性增大，易溶于稀酒精溶液中，不能进入苯层；而类胡萝卜素在苯中的溶解度大于在醇溶液中；一部分苯分散在水中形成乳胶体，出现一层乳白色的溶液。低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白色絮状物，溶液浑浊，且不分层。2）取代反应卟啉环中的Mg处于不稳定的状态，可被H+、Cu2+、Zn2+等离子取代。稀酸：叶绿素溶液与稀酸作用，Mg可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，去镁叶绿素遇Cu2+则成为深绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏（常用醋酸铜处理来保存绿色植物标本）。浓酸：叶绿素溶液与浓酸作用，Mg被H+取代，且生成的去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色。1）吸收光谱红光区：640~660nm；篮紫光区：430~450nm。2）荧光现象叶绿素溶液在透射光下呈绿色，而在反射光下呈红色。3）皂化反应叶绿素是叶绿酸的酯，可与碱起皂化反应而生成醇和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。4）取代反应在稀酸中，叶绿素中的镁可以被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇Cu2+则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏。在浓酸中，叶绿素中的Mg被H+取代，且生成的去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，呈褐绿色。5）叶绿素的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素的理化性质1）叶绿素a、b分别在665nm和649nm波长处（95%乙醇提取）有最大的吸收峰，同时在该波长处叶绿素a，b的比吸收系数K为已知，我们即可以根据Lambert-Beer定律，列出以下关系式：Ca=13.95A665–6.88A649Cb=24.96A649–7.32A665CT=Ca+Cb=18.08A649+6.63A665A665和A649为叶绿素溶液在波长665nm和649nm时的吸光度Ca、Cb、CT分别为叶绿素a、b及总的浓度，以mg·L-1为单位2）叶绿素a、b在652nm波长处有相同的比吸收系数（均为34.5），在此波长下测定叶绿素溶液的吸光度，也可计算出叶绿素a、b的总浓度。CT=（A652×1000）÷34.53）叶绿素的含量（mg/g）=[叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重2.4叶绿素含量的计算3.材料、仪器设备与试剂材料：菠菜叶片仪器：试管、容量瓶、研钵、分光光度计、水浴锅，等。试剂：石英砂、碳酸镁、95％乙醇、20%NaOH-甲醇、苯、36%乙酸、醋酸铜、浓盐酸叶绿体色素提取称取新鲜去大叶脉的菠菜叶片3g，剪碎放入研钵中，加少量石英砂和碳酸镁及5ml95％乙醇，研成均浆，过滤入25ml容量瓶，分别用5ml95％乙醇冲洗研钵3次，冲洗液同样过滤，收集滤液，倒入容量瓶中，最后用95％乙醇定容至25ml，放入暗处备用。2.光对叶绿体色素的破坏作用取两支试管