激光扫描共聚焦显微镜教学课件.pptVIP

激光扫描共聚焦显微技术Laserscanningconfocalmicroscopy?

激光扫描共焦显微镜的设计特点:?1.点照明,具有照明pinhole和探测pinhole?2.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦),共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面?3.具有扫描系统——逐点扫描成像?4.激光作为光源?5.具有多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物

ConfocalMicroscopeFluorescentMicroscopeArcLampLaserExcitationDiaphragmExcitationFilterExcitationPinholeExcitationFilterPMTOcularObjectiveObjectiveEmissionFilterPinholeEmissionFilter

人眼分辨率：0.2mm光学显微镜分辨率：0.25mm电子显微镜分辨率：0.2nm共焦显微镜分辨率：0.18mm

?电子显微镜的缺点：1.由于样品需要固定,观测活细胞十分困难.2.样品制备过程（固定、包埋、切片）造成的假象?荧光显微镜的缺点:1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多荧光的同时采集2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。3.荧光漂白很快，使荧光图像的拍照有困难。4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作.5.对于信号较弱的样本,无法提高观察的灵敏度.6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重叠

激光共聚焦显微镜的应用?单、双、三,四色标记检测。?精确的一、二、三、四维观察。?高品质的荧光成像、透射成像、物体表面反射成像。?静态和动态观察(CA,pH,膜电位,膜流动性等)。2+?定性以及定量分析。?光谱扫描,ROI扫描.?特殊的光反应(FREP,FRAP,CAGED-UNCAGED等)。

激光共聚焦显微成像技术的应用明场，DIC,相差和透射光图像单标，双标和三标图像时间分辨和快速扫描动态图像出色的反射光图像

一.定位、定量?免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位、定量如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位、干细胞的分化?细胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI末端原位杂交-fitc+PI?荧光原位杂交：染色体基因定位?单细胞凝胶电泳?GFP的表达?活细胞或活体组织静息游离Ca2+的分布与定量?活细胞内pH的定量、膜电位的测量?活细胞内自由基水平的定量

Immuno-fluorecencelabelgreen-中心体red-纺锤体

二.光学切片和三维重组光学切片和三维重组:LSCM通过薄层光学切片功能，可获得标本真正意义上的三维数据，经计算机图像处理及三维重建软件，产生生动逼真的三维效果，可进行形态学观察，并揭示亚细胞结构的空间关系，用以阐明三维结构与组织功能之间的关系。

显微CT与三维重组

3Dreconstruction

三.动态测量游离Ca2+,Mg2+、K+、Na+测量pH的?自由基的检测

?相对测量?程序化测量：用timelapse中的编程按钮可进行不同时间?序列的扫描测量?F/F=(F-F)/(F-F)basebaseBG

四.细胞膜电位的测量标记膜电位探针(慢反应）：JC1510nm548nm484nm530/590nm573nmDioc5(3)Dioc6(3)快反应探针：500nmDi-4-ANEPPS496nmDi-4-ANEPPS498nm细胞膜静息膜电位：-70mV线粒体膜电位：-150mV703nm713nm以上均属于阳离子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针

?五.荧光漂白恢复(FRAP:FluorescenceRecoverafter%Fphotobleaching）IntenselaserBeamBleachesFluorescenceTimeRecoveryoffluorescenceZerotime10seconds30secondsFRAP(Fluorescencerecoveryafterphotobleaching)原理

荧光光漂白后的回复：FRAP§生物膜脂质分子的侧向扩散；§胞间通讯的研究；§胞浆及细胞器内小分子物质转移性的观测等§细胞骨架构成、核膜结构及大分子组装等。

六．荧光能量共振转移(fluorescenceResonanceEnergyTransfer)能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能量供体，能量的接受者叫能量受体。荧光能量共振转移的条件