大学生创新创业训练计划结题报告——酿酒酵母Mcm10遗传突变分析.pdf

中文题目：酿酒酵母Mcm10遗传突变分析

英文题目：Geneticscreenofsuppressorsofmutantsinthe

Saccharomycescerevisiae

项目背景：蛋白家族由十个保守的因子组成，在古细菌和真核生物基因组复制过程中

发挥作用。其中，MCM2-7组装形成DNA解旋酶，在DNA复制过程中负责解开双链。Mcm8

和Mcm9同样属于解旋酶家族，且只在多细胞生物中存在。但Mcm8的功能与Mcm2-7不

同，而Mcm9的功能也是未知数。MCM1属于MADS转录因子家族，参与调节一些复制因

子的表达。下图所示为真核生物DNA复制时的复制叉，

图1.真核生物DNA复制

DNA复制延伸的时候具有解旋酶Mcm2-7在复制的方向上解开DNA双链，Polδ和Pol

ε分别合成后随链和前导链，在DNA复制过程中，解旋酶和复制酶在功能上必须协调一致。

Mcm10不是MCM家族的成员。Mcm10作用于MCM结合之后。Mcm10的作用主要是：1、

协调MCM2-7解旋酶和DNA聚合酶的活动；2、确保稳定和复制叉的完整。在酿酒酵母中，

Mcm10作为桥梁在后随链上偶联解旋酶和聚合酶Polα。Polα在后随链上负责合成一段引

物并延伸一小段DNA。

Mcm10的两个温度敏感突变株-1和mcm10-43在允许生长温度下DNA复制起始

速率变慢；但在限制生长温度下，发生细胞周期停滞，Mcm10蛋白降解，细胞死亡。为了

研究Mcm10的必需功能，筛选mcm10-1和mcm10-43TS菌株在限制条件下的抑制子。研究

发现，当Mcm10这个桥梁不存在时，mcm2突变体可以通过降低解旋酶活性来增强与聚合

酶α的物理相互作用，使细胞存活下来。具体机理见下图：

2、突变抑制mcm10突变条件致死的机制

模型显示，Mcm10的降解使Polα从复制叉上街解离，因此解旋活性和复制活性不能协

调一致，使得大量的单链DNA聚集，复制叉崩塌，检验点激活。而解旋酶的突变削弱了解

旋的活性使得解旋酶其后的聚合酶在没有偶联因子的情况下也能行驶一定的复制能力。这种

有缺陷的同步化使得单链DNA偶尔得暴露在较低程度上激活检验点，使得检验点的蛋白招

募到复制叉上替代Mcm10的链接作用。

Mcm2-7各个亚基均会影响解旋酶活性，除了Mcm2亚基，其他MCM亚基突变可能也

会通过降低解旋酶活性而成为mcm10-1和mcm10-43TS菌株的抑制子。同时可能一些其他

基因的突变也可能成为mcm10-1突变的抑制因子。

另外，Mcm2-7解旋酶活性调节非常复杂，一些激酶或磷酸酶可能通过磷酸化或去磷酸

化来调节其活性。通过这些激酶和Mcm10的基因上下位效应分析，可能会初步回答Mcm2-7

解旋酶活性是如何被调控的这一问题。对于整个复制叉的各个组分是如何协调工作以保证

DNA精确复制这一谜题的解开，也会起推动作用。

具体实施方案及成果：

一、载体构建：

构建MCM2基因到酵母表达载体p426Gal。

经测序证明载体p426Gal1-MCM2构建成功。测序比对结果见下图：

二、酵母转化：

1)收集培养好的菌体到一个EP管中，离心2500rpm,5min；

2)弃培养液，把细胞悬浮在25ml无菌水中，再同上离心；

3)弃水，把细胞悬浮在1ml的100mmol/L醋酸锂中，将悬浮物转移到无菌的1.5ml的EP

管中。

4)高速离心15s沉淀细胞，吸走醋酸锂。

5)悬浮细胞到终体积500µl，其中大约含400µl的100mmol/L的醋酸锂；

6)将1ml鲑鱼精单链DNA煮沸5min，快速在冰水中冷却；

7)震荡细胞悬浮液，取50ul样品到标记的离心管中，离心沉淀细胞，去除上清；

：

PEG3350（50%w/v）240µl

1.0mol/L醋酸锂