分子标记课件.ppt

SimpleandquicklyPCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2-4小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广

PCR-basedMarkersRAPD,SSR,andetc.PCRBasedMarker—RAPD发明：是Williams等人于1990年首创的一种DNA技术，被称为RandomamplificationofPolymorphicDNA(随机扩增的多态性DNA）原理：以PCR为基础,利用人工合成的约10b的随机序列寡核苷酸作引物,以生物的基因组DNA为模板,进行PCR扩增,产生不连续的DNA产物,通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA序列的多态性。RAPD反应的循环次数可多达40—50次,每次循环中,双链DNA在95℃的高温下变性,解开双螺旋成为单链模板,然后在低温(36℃)条件下与随机引物结合,在DNA多聚酶的作用下，按碱基互补原则沿5‘至3’的方向把核苷酸链延长，完成DNA复制。如此反复数十次,可以使单一的DNA序列扩增105-107倍。PrincipleofRAPDRAPD操作PCR反应体系：DNA（20ng/μl） 1μlPrimer 15ng10×Buffer 2.0μlMg2+（25mM） 1.2μlTaq酶（5U/μl） 0.15μldNTP（25mM） 0.2μl加水至20μl，再加入石腊油，进行PCR扩增。RAPDStep195℃2分钟Step295℃15秒Step336℃30秒Step472℃45秒Step5GOTOStep246循环Step672℃5分钟?PCR扩增程序：RAPDRAPDRAPD标记特征：①引物很短（10base）②只有1种引物参与反应③引物在染色体上随机结合④退火温度低一般为35-37℃⑤当两引物在互补的模板DNA链上的结合位点距离小于2000bp便可扩增出该区域。RAPD优点：--实验步骤少，省工、省力、进度快--不需先知道基因组的任何分子信息--所用材料不需有性世代，可用任何单一亲本--引物具有广泛性和通用性。缺点：RAPD是一种显性标记,不能区分纯合子与杂合子；易受实验条件的影响,表现为扩增产物的稳定性差。RAPD标记RAPDSSR:SimpleSequenceRepeat，简单重复序列，又称微卫星DNA（microsatellite）或短的串联重复（ShortTandemRepeat,STR)。微卫星DNA：一类由几个核苷酸（一般1-5个，基序很短）为重复单位串联而成的DNA序列。微卫星DNA广泛存在于真核生物中，人和动物（TG）n，植物（AT)n微卫星DNA长度的多态性;微卫星DNA两端多是高度保守的单拷贝序列。SSR标记微卫星DNA的类型单核苷酸重复(Mononucleotide)(A)11 AAAAAAAAAAA2、 二核苷酸重复(Dinucleotide)(GT)6 GTGTGTGTGTGT3、 三核苷酸重复(Trinucleotide)(CTG)4 CTGCTGCTGCTG4、 四核苷酸重复(Tetranucleotide)(ACTC)4 ACTCACTCACTCACTC不同物种其重复序列及重复单位频率不同。通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNASSR(1-4bp)的搜索,发现：(AT)ｎ最丰富,然后依次是:(A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、(AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT)n、(AATT)n、(TTAA)n、(AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。同一类内碱基种类不同的SSR,丰度差别很大。SSRTypesofMicrosatellitesHomozygous…CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG……CGTAGCCTTGCATCCTTCTCTCTCTCTCTCTATCGGTACTACGTGG… 5’fl