低强度脉冲超声波对脂肪干细胞成骨分化效能的影响-细胞生物学论文-生物学论文.pdf

效能的影响细胞生物学论文-生物学论文

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超声波是一种高频声波，也是机械能的一种形式，通过高频

(1～12MHz)的压力波来传递能量，低强度脉冲超声波(LIPUS)一

般指强度＜100mW/cm2的超声波。20世纪80年代初Duarte首

先报道了LIPUS(强度为30mW/cm2)能加速动物骨折愈合，他们的

研究进一步发现:低强度脉冲超声波可刺激骨折愈合，缩短愈合时间。

根据Wolf定律骨的形成与结构可随外力的大小与方向而重建，骨

骼的生理反应和愈合过程可受机械力学影响，超声产生的机械力刺激

是否也能对骨骼的愈合产生影响逐渐受到人们的关注。干细胞的分化

方向不仅取决于其自身与外界调控信号之间的相互作用，而且还受到

周围组织的三维结构及机械力的影响。而脂肪干细胞(adiposederived

stemcells，ADSCs)以其来源丰富、较易获取、一次取材即可获取大

量细胞及对机体创伤较小等优点，成为继BMSC以外另一个研究热

点。本实验旨在研究低强度脉冲超声波对脂肪干细胞成骨分化效能的

影响。

1材料、仪器和试剂

1.1标本采集脂肪细胞取自于无锡市人民医院18～45岁

手术患者，部位为腹部及腰背部处，不合并重大内科疾病，经知情同

意。取下的脂肪细胞经分离培养后用于本实验。

1.2实验试剂和材料DMEM－低糖培养基(美国Hyclone

公司)，Gibco胎牛血清(美国Invitrogen公司)I型胶原酶、胰蛋白

酶、BSA(美国Sigma公司)，青链霉素(美国GIBeo公司)，地塞

米松(美国Sigma公司)，维生素C(美国Sigma公司)，油红O

(美国Sigma公司)，吲哚美辛(美国Sigma公司)，IBMX(美国

Sigma公司)，EDTA(美国Sigma公司)，CD29/CD14/CD44/CD45

/CD105抗人单克隆抗体，抗鼠IG1、IG2，EDTA(美国Sigma公司)

碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成)，培养板及培养瓶(Corning公

司)，Exogen2000超声波骨折治疗仪(诺亚)，医用超声耦合剂

(上海洪康)。

1.3脂肪间充质干细胞(ADSCs)的分离培养脂肪组织剪成

5ml的离心管中，加入5倍

体积的0.1%Ⅰ型胶原酶溶液，密封离心管。将离心管放入37Ⅰ的恒

温振荡箱中，振荡消化45～60min，等体积DMEM－低糖培养基

中和，1500r/min离心10min。弃上清，用PBS溶液离心漂洗沉淀

两次。加入培养基重悬沉淀，200目不锈钢筛网过滤，1500r/min离

心5min。培养基重悬后，制成细胞悬液，然后细胞计数，按2105

的密度接种于35cm35cm的培养瓶内，置于37Ⅰ、5%CO2的饱和

湿度恒温培养箱中培养。于12h后首次半量换液，之后每3d更换

1次培养液。当细胞达到90%融合时用约1ml，0.02%EDTA+0.25%

胰蛋白酶的混合消化液(1Ⅰ1体积比)37Ⅰ消化1～2min，待细胞回

缩成圆形时加入培养基中和，并以1Ⅰ2或1Ⅰ3传代培养。

1.4ADSCs的表面抗体检测取第6代生长接近融合的细胞，

以0.02%EDTA+0.25%胰蛋白酶的混合消化液消化，加入适量PBS，

以1300