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Elisa常见类型与实验标准操作方法与常见问题

酶联免疫吸附试验〔ELISA〕是一种实验室常用的检测方法，广泛应用于测量溶

液中的分析物〔抗体或抗原〕的浓度。与其他基于抗体的检测方法不同的是，酶

联免疫吸附试验或酶免疫测定〔EIA〕通过与固相支持物的结合和系列洗涤步骤，

实现特异性和非特异性相互作用的别离，并可通过最终有色产物的形成，定量分

析原始样品中分析物的含量。

ELISA实验通常以细胞培养上清液、血清、血浆以与组织裂解物等为样品。该

实验必备三种试剂：固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶作用的底物。

根据样品的性质、检测的实验条件、试剂的来源，可设计出不同类型的ELISA

检测方法。

该实验可迅速分析大量平行样品，在根底研究和临床诊断实践中广泛使用。

一、直接ELISA

原理：将抗原与固相载体连接，洗涤除去未结合的抗原与杂质。加酶标抗体进展

孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。

此时固相上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。加底物反响。直接法主要用

于测定抗原。

优点：操作流程简短，实验步骤少；无需使用二抗，防止了交叉反响；实验步骤

少，操作不易出错。

缺点：实验中的一抗需要直接用酶标记，本钱相对较高。

二、间接法ELISA

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原理：将抗原与固相载体相连结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原与杂质。

参加特异性一抗与固相抗原相结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，加酶

标二抗。固相免疫复合物中的抗体与酶标二抗结合，从而间接地标记上酶。洗涤

后，加底物显色。

优点：酶标二抗可加强信号，提高灵敏度；灵活性更大，同一酶标二抗可应用于

多种不同的一抗；不直标一抗，可保存更多的免疫反响性；本钱更低，使用标记

抗体更少。

缺点：交叉反响几率升高。

三、双抗夹心法ELISA

原理：双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子，但不适用于小分子抗

原。将特异性抗体〔捕获抗体〕与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤除去未结

合的抗体与杂质。参加待检样品，保温孵育。样品中的特异性抗原与固相抗体结

合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。加酶标抗体〔检测抗

体〕保温孵育。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶

标抗体。加底物反响。

双抗原夹心法测抗体的反响模式与测抗原相似，用特异性抗原进展包被和制备酶

结合物，以检测相应的抗体。

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优点：高特异性，使用的捕获抗体与检测抗体都是检测特异性的；适用于复杂样

品，抗原不需要进展纯化即可用于检测；灵活性更大，灵敏度更高，可采用直接

法也可采用间接法。

缺点：检测物需要拥有两个以上不同的抗原表位或多个一样的重复表位；不适用

于检测小分子物质。

四、竞争法ELISA

原理：竞争法ELISA最为复杂，通常用于检测小分子如半抗原、激素、药物等。

样品中待检游离抗原与固定于固相载体上的抗原一起竞争一样的有限量抗体，当

样品中的游离抗原越多，就可结合越多的抗体，而固相抗原只能结合较少的抗体。

反之亦然。经洗涤去除样品中的抗原与抗体的结合物，只留下固相抗原与抗体的

结合物。显示经计算可得样品中抗原的含量。竞争法可根据实验设置直接法、间

接法或夹心法形式。

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常见问题：

Elisa实验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个

环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。

下面一步步分析Elisa试验操作中可能影响结果因素。

Step1:标本的选择与准备

用于ELISA测定的临床标本最为常用的是血清(浆)，有时因为特定的检测目的，也用到唾液、

脑脊液、尿液、粪便等标本。目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的