生物化学：第六章 核酸.ppt

大肠杆菌5SrRNA结构P498图13-2016S、5SrRNA的结构★rRNA的功能：●组成核糖体●催化肽键形成的转移酶活性存在于23SrRNA上●参与tRNA与mRNA的结合第三节??核酸的物理化学性质一、核酸的水解（一）酸水解★对酸的敏感性：糖苷键＞磷酸二酯键嘌呤糖苷键＞嘧啶糖苷键★脱嘌呤：pH1.6，37℃，对水透析pH2.8，100℃，1h★脱嘧啶：98-100%甲酸，175℃，2h三氟乙酸，155℃，60min（DNA）或80min（RNA）★利用酸水解可以研究核酸的碱基组成（二）、??碱水解★RNA的磷酸酯键对碱敏感室温，0.3~1mol/LKOH，24h，先形成2’-和3’-的环磷酸酯，可将RNA完全水解，得到2’-或3’-核苷酸的混合物。★DNA抗碱水解★生理意义：DNA更稳定，可用于DNA和RNA的分离。（三）、??酶水解★非特异的磷酸二酯酶：蛇毒磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得5’-核苷酸牛脾磷酸二酯酶水解DNA（RNA）得3’-核苷酸★特异的磷酸二酯酶：核酸酶1、核酸酶的分类★底物专一性：核糖核酸酶RNase脱氧核糖核酸酶DNase★作用方式：核酸外切酶（exonuclease)、核酸内切酶(endonuclease)单链核酸酶、双链核酸酶、杂链核酸酶★磷酸二酯键的断裂方式：5’-（寡）核苷酸3’-（寡）核苷酸2、RNAase★RNaseH作用于DNA-RNA中的RNA链，内切酶。★牛胰核糖核酸酶（pancreaticribonuclease),RNaseI最适pH：7.0-8.2产物：以3’-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸，高度专一的内切酶★RNaseT1耐热、耐酸产物：以3’-鸟苷酸结尾的寡核苷酸或3’-鸟苷酸，专一性更高，也是内切酶。★RNaseT2产物：以3’-腺苷酸结尾的寡核苷酸，内切酶。3、DNase★核酸酶S1作用于单链DNA部分，为内切酶。★牛胰脱氧核糖核酸酶，DNaseI切断双链或单链DNA产物：以5’-磷酸为末端的寡核苷酸★DNA限制性内切酶：主要是降解外源DNA。目前已找到的已有数千种，主要用于基因工程的工具酶，在基因工程中广为应用的也有几百种。4、N-糖苷酶：具有碱基特异性或非特异性，水解糖苷健。二、?核酸的酸碱性质磷酸和碱基均能发生两性解离。DNA等电点4—4.5RNA等电点2—2.51、碱基的解离王镜岩P504由于嘧啶和嘌呤化合物杂环中的氮以及各种取代基具有结合和释放质子的能力，所以这些物质既有碱性解离又有酸性解离的性质，但主要是碱基中的氮的解离。2、核苷的解离王镜岩P5051)核糖的存在降低了碱基的解离常数，即增强了碱基酸性解离。2）核糖也可以解离，但解离常数通常在12以上，一般不去考虑它。3、核苷酸的解离王镜岩P506表14-1某些碱基、核苷、核苷酸的解离常数1）增加了磷酸基的两个羟基解离。在多聚核苷酸中磷酸二酯健只有一个解离，并代负电荷。2）腺苷酸，鸟苷酸，胞苷酸可以形成兼性离子，pI=1\2(pk1’+pk2’)。尿苷酸的碱基碱性极弱，故不能形成兼性离子。4、核酸的滴定曲线P507图14-1核苷酸的滴定曲线P507图14-2小牛胸腺DNA的滴定曲线DNA的酸碱滴定曲线对了解DNA的酸碱变性很有帮助。三、?核酸的紫外吸收碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收，λmax=260nm1、??鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8（1.65-1.85）纯RNA的A260/A280应为2.0。若溶液中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低。2、??含量计算：以DNA或RNA标准品作标准曲线，可测定样品中DNA或RNA的含量。1个光吸收值值相当于：50ug/mL双螺旋DNA或：40ug/mL单链DNA（或RNA）或：20ug/mL寡核苷酸3、判断DNA是否变性或降解在DNA的变性过程中或降解时，其紫外吸收值增大叫增色效应。在DNA的复性过程中，其紫外吸收值减小叫减色效应。四.核酸的溶解性质1.DNA和RNA都能溶解在水溶液中，而不溶于乙醇和氯仿等有机溶剂中。可以利用乙醇把核酸从水溶液中沉淀下来。2.DNP和RNP复合体