碱裂解法中提质粒 from HJJ modified by Edwin Wan at 07.08.30.docx

碱裂解法中提质粒

试剂：

1GTE:50mMGlucose,25mMTris8.0,10mMEDTA2Lysisbuffer:200mMNaOH,1%SDS

4MKOAc(80mls5MKOAc,11.5mlsglacialaceticacid,8.5mlsHO)

2

Isopropanol

TE+RNase:10mMTris,1mMEDTA,20ug/mlRNase

PEGSolusion:40%PEG-8000,30mMMgcl（PEG8000不需要灭菌）

2

70%EtOH

过程：

摇菌：从-80℃挑取菌种接种到40ml含相应抗性的LB中，剧烈振摇12-16h

收菌：预冷50ml离心管，将摇好的菌液倒入离心管中。平衡后，离心(5000rpm,4℃,10min.；8000rpm,10mins;10000rpm,5mins)

离心中间:

拿出GTE、KOAC，冰上预冷。

配LysisBuffer30ml:

100ml,2MNaOH 10ml

30ml,

2MNaOH

3ml

10%SDS 10ml

10%SDS

3ml

ddH20 80ml

ddH20

24ml

加入1.8ml预冷的GTE,剧烈斡旋(冰上操作，不要留有菌块，会影响裂解)。

加入3.6mlLysisBuffer,轻柔地颠倒6-10次。室温静置2min，拉开盖子，可见粘丝。

液体变澄清后，向离心管中加入5.4mlKOAC，轻柔地颠倒6-10次。冰浴10mins.

7．离心：4℃/22-26℃，14000rpm,10min*2.(离心两次，每次14000rpm，10mins,中间换新管)不要制动，让离心机慢停，从离心机拿出时也要小心，防止沉淀晃起。

8．吸上清到新的50ml离心管中，一定注意不要吸到沉淀（直接影响纯度）。向离心管上清中加入异丙醇5ml(上清的1/2（)最好能准确定量上清的量，然后加入1/2体积的异丙醇），颠倒混匀（动作轻柔）。

6. 离心：22-26℃，14000rpm,20min。小心倒掉上清，用70%乙醇洗两次，每次充分转匀就好。倒扣在桌面卫生纸上（要防止沉淀掉落），干燥。

离心中间：1）打开水浴箱，调整到37℃；2）配含有RNaseA的TE，放冰上。RNase的储存浓度为10mg/ml,1:300稀释用，即3mlTE中加入10μlRNase.

向离心管中加入TE（含有RNase）3.0ml，37℃水浴1h,或者37℃孵箱1.5h.

向离心管中加入1.5mlPEG-8000（最大的EP离心管为4.5ml，吸取时吸取2.8ml溶液，然后加入1.4mlPEG8000）,反复吸打管壁混匀后，转移到5ml的离心管中。

离心：室温，13500rpm,15min.倒掉上清，一定要小心，防止白膜脱落。将离心管倾斜扣在试管架上，晾干。配75%乙醇。

向离心管中加入4ml75%乙醇,离心：13500rpm,5-10min.

重复12两次。小心倒掉上清，倒置在试管架上，晾干（不要太干，不易溶解）。配10mMTris-Hcl。

向离心管中加入150μl（直接影响浓度，可根据最后得到的质粒的量进行调整）10mMTris-Hcl。（Tris-Hcl的储存浓度为1M，需1：100稀释用）（对着光，检查是否将管壁上的质粒完全溶下来）

取EP管中，详细标记，用以保存质粒。

取EP管，粗略标记，用以检测质粒（98μl+2μlddH20）。去刘德陪实验室测质粒浓度及纯度。

开机自检

按“DNA”

按“Setup”,改动最后一个参数，即稀释倍数为1：50

放ddH2O 80μl,按“Setref”,空白调零。

放样品80μl，按“DNA”，记录结果。

用完一次，要用水冲洗干净，吸干测试杯中的水后，再加入下一个样品。擦干测试杯后开始检测。用完后将杯子冲洗干净，放入抽屉中的乙醇杯中。

按“stop”,关掉电源

Notes：

王菲师姐认为，质粒的超螺旋的比例受细菌生长状态的影响，细菌应该在生长旺盛没有摇过的条件下取出，提取质粒。

2．