实验十三、放线菌素D诱导细胞凋亡形态学观察.ppt

实验十三、细胞凋亡的诱导及观察2002年10月7日，瑞典卡罗林斯卡医学院诺贝尔奖评审委员会将2002年诺贝尔生理学或医学奖授予了悉尼·布雷内、罗伯特·霍维茨和约翰·苏尔斯顿三位科学家，以表彰他们在“细胞程序性死亡”这一领域中的开创性工作。他们不但发现在生物的器官发育过程中存在细胞程序性死亡，而且阐明了细胞程序性死亡过程中的基因规律。一、细胞死亡（celldeath）定义：细胞生命现象不可逆的停止，分为两种形式，即坏死性死亡和程序性死亡。1.坏死性死亡（necrosis）定义：细胞外部的化学、物理或者生物的因素的侵袭而造成的细胞崩溃和裂解，是被动的死亡。2.程序性死亡（programmedcelldeath,PCD）定义：又称细胞凋亡（apoptosis），细胞在一定的生理或者病理条件下按照自身的程序结束其生存，是细胞接受指令后进行的主动性死亡，涉及一系列基因的激活、表达和调控。3.细胞坏死和程序性死亡的区别细胞的两种死亡方式及比较4.程序性细胞死亡的特征形态特征：细胞变圆、胞质皱缩，细胞体积减小，染色质凝聚，核碎裂成为染色质块（核碎片）。整个细胞通过发芽、起泡等方式产生一些球形突起，并在基部脱落形成大小不等的、内含胞质、细胞器和核碎片的凋亡小体（apoptoticbody）。最后凋亡小体被周围的细胞或者单核细胞吞噬。凋亡小体生化特征：内源性核酸内切酶基因的活化和表达，导致凋亡细胞的染色质DNA的有控裂解，得到的DNA片段的长度为200bp的倍数。二、程序性细胞死亡的意义1.动物机体靠对细胞增殖和细胞周期的正负控制以及对程序性细胞死亡的正负控制来维持细胞总数的平衡和机体的生命活力。2.程序性细胞死亡在形态建成中起到重要作用（如手指和脚趾的发育），或者对于不再需要的构造加以消除（如蝌蚪尾巴的消除）。3.程序性细胞死亡还能够调节细胞的数量和质量。实验五、细胞凋亡的观察原理：HeLa细胞经放线菌素D诱导后，可以产生不同程度的细胞凋亡，利用荧光染色，可以观察到典型的凋亡核（核碎片）。凋亡核呈颗粒团状分布，颜色较正常细胞致密且浓染。材料及设备：HeLa贴壁培养细胞、250mg/ml放线菌素D（ActinomycinD）、吖啶橙荧光染料、卡诺氏固定液、0.9%生理盐水、10%甘油荧光显微镜、盖玻片、载玻片、镊子、一次性吸管、离心机、EP管、培养皿、小烧杯等。实验步骤1.诱导：向处于对数生长期的Hela细胞中加入250mg/ml的放线菌素D溶液10~15μl（终浓度0.5~0.75ug/ml），继续培养18h左右；2.细胞收集和洗涤：将细胞悬液平均转移到4个1.5毫升的EP管中，用1ml生理盐水清洗细胞,去掉生理盐水,将瓶壁上剩余细胞用1ml0.25%的胰酶消化3min后，将细胞悬液加入培养皿,吹打生长面,平均合并至4个EP管中。以2000rpm离心6-8min，去上清；3.细胞预固定和固定：加入0.9毫升生理盐水，悬浮细胞，使细胞分散，加入0.1毫升卡诺氏固定液，混匀；离心，去上清（保留0.1毫升生理盐水）；加入固定液至1毫升，小心悬浮细胞，室温下固定处理10min，离心，去上清，加入0.1毫升固定液，小心充分混匀细胞；取一滴细胞悬液，滴于倾斜放置的洁净盖玻片上，让细胞均匀分散，自然干燥。4.制片（空气干燥法）5.染色：滴加一滴吖啶橙荧光染液于标本上，铺开染液，置标本于培养皿中，室温下黑暗环境中染色10min，自来水小心冲洗,自然晾干（避光）。6.封片及观察：在载玻片（slide）上滴一滴10%的甘油，用镊子小心将贴有细胞的盖玻片盖在液滴上，细胞面向下，不要产生气泡，及时于荧光显微镜下观察。结果*不释放内含物，不引起炎症细胞裂解释放出内含物，常常引起炎症反应结果细胞收缩，割裂成膜性小泡后被吞噬质膜通透性增高，细胞肿胀，细胞器变形、肿大，早期核无明显变化，最后破裂过程基因控制物理、化学因子的损害，缺氧、营养不良等原因细胞程序性死亡细胞坏死程序性细胞死亡对发育中神经细胞数量的调节coverslip*