(1.8)--蛋白质电泳技术改.ppt

蛋白质电泳技术

发展历史不同类型电泳及凝胶选择01.02.目录

01发展历史

发展历史011809年俄国物理学家Рейсе首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。1909年Michaelis首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。1937年瑞典Uppsala大学的Tiselius对电泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的诺贝尔化学奖。

发展历史011948年Wieland和Fischer重新发展了以滤纸作为支持介质的电泳方法，对氨基酸的分离进行过研究。从本世纪50年代起，特别是1950年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。

发展历史011959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即电泳纯（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即LastCheck.

02不同类型电泳及凝胶选择

不同类型电泳及凝胶选择02电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。于是出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳过程，减少了扩散和对流等干扰作用。最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。

不同类型电泳及凝胶选择02在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析，但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。

琼脂糖凝胶02由于琼脂糖凝胶的弹性较差，难以从小管中取出，所以一般琼脂糖凝胶不适合于管状电泳，管状电泳通常采用聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶通常是形成水平式板状凝胶，用于等电聚焦、免疫电泳等蛋白质电泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式电泳应用得相对较少。

聚丙烯酰胺凝胶02聚丙烯酰胺凝胶的孔径可以通过改变丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度来控制，丙烯酰胺的浓度可以在3％－30％之间。低浓度的凝胶具有较大的孔径，如3％的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质没有明显的阻碍作用，可用于平板等电聚焦或SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩胶，也可以用于分离DNA；高浓度凝胶具有较小的孔径，对蛋白质有分子筛的作用，可以用于根据蛋白质的分子量进行分离的电泳中，如10％－20％的凝胶常用于SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离胶。

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳02SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）制备凝胶时首先要根据待分离样品的情况选择适当的分离胶浓度，例如通常使用的15％的聚丙烯酰胺凝胶的分离范围是104～105，即分子量小于104的蛋白质可以不受孔径的阻碍而通过凝胶，而分子量大于105的蛋白质则难以通过凝胶孔径，这两种情况的蛋白质都不能得到分离。所以如果要分离较大的蛋白质，需要使用低浓度如10％或7.5%的凝胶（孔径较大）；而对于分离较小的蛋白质，使用的较高浓度凝胶（孔径较小）可以得到更好的分离效果。分离胶聚合后，通常在上面加上一层浓缩胶（约1cm），并在浓缩上插入样品梳，形成上样凹槽。浓缩胶是低浓度的聚丙烯酰胺凝胶，由于浓缩胶具有较大的孔径（丙烯酰胺浓度通常为3～5％），各种蛋白质都可以不受凝胶孔径阻碍而自由通过。浓缩胶通常pH值较低（通常pH=6.8），用于样品进入分离胶前将样品浓缩成很窄的区带。浓缩胶聚合后取出样品梳，上样后即可通电开始电泳。

梯度凝胶电泳02梯度凝胶电泳也通常采用聚丙烯酰胺凝胶，但不是在单一浓度（孔径）的凝胶上进行，而是形成梯度凝胶。从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变