酶的固定修饰与改造.ppt

（三）酶的异源表达1.酶基因在原核生物中的表达（1）原核生物基因表达系统的特点①只有一种RNA聚合酶；②表达是以操纵子为单位的；③转录与翻译偶联，是连续进行的；④一般不含内含子；⑤基因表达控制主要在转录水平；⑥大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上含有真核生物缺乏的转译起始密码子及SD序列。（2）原核生物基因表达载体：（3）影响原核生物基因表达系统表达效率的因素：很多；如启动子结构、转译起始序列、启动子同克隆基因间的距离、质粒拷贝数及稳定性等等。2.外源基因在真核细胞中的表达：真核生物表达载体（主要是穿梭载体）、受体细胞（如酵母细胞、植物细胞、动物细胞、昆虫细胞等）。第91页,共105页，2024年2月25日，星期天3.酶异源表达的应用非常广泛。（1）农业：作物改良（抗病、抗虫、抗逆等）；（2）工业：生产用酶的制造。（3）医学：（4）环境保护：（5）能源：第92页,共105页，2024年2月25日，星期天二、酶分子的改造（一）酶的定点突变（二）酶分子定向进化第93页,共105页，2024年2月25日，星期天（一）酶的定点突变（site-directedmutagenesis;SDM）酶的定点突变（site-directedmutagenesis;SDM）是指在基因的特定位点引入突变,即通过取代、插入或删除已知DNA序列中特定的核苷酸序列来改变酶蛋白结构中的某个或某些特定的氨基酸，以此来提高酶对地物的亲和力，增强酶的专一性等。第94页,共105页，2024年2月25日，星期天1.寡核苷酸引物突变（1）制备待突变基因并克隆到突变载体上；（2）制备含待突变基因的单链模板；（3）突变寡核苷酸引物欲待突变核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链DNA；（4）合成突变链：（5）转化和初步筛选突变的异源双链DNA分子。第95页,共105页，2024年2月25日，星期天2.PCR介导的定点突变第96页,共105页，2024年2月25日，星期天PCR介导的定点突变第97页,共105页，2024年2月25日，星期天3.盒式突变盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段取代野生型基因中的相应序列。突变序列含有黏性末端，靶DNA区段需存在一对限制性内切酶位点。第98页,共105页，2024年2月25日，星期天（二）酶分子定向进化酶分子的合理设计(rationaldesign)酶分子的定向进化(directedevolution)第99页,共105页，2024年2月25日，星期天酶分子的合理设计

(rationaldesign)第100页,共105页，2024年2月25日，星期天酶分子的定向进化(directedevolution)理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制(随机突变、重组和自然选择)，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。第101页,共105页，2024年2月25日，星期天定向进化的原理在待进化酶基因的PCR扩增反应中，利用TaqDNA聚合酶不具有3’→5’校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+选择。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的。第102页,共105页，2024年2月25日，星期天定向进化的方法1.易错PCR2.DNA重组3.外显子改组4.随机引物体外重组法5.交错延伸法第103页,共105页，2024年2月25日，星期天酶的体外定向进化应用实例1.提