实验七高氏1号培养基的制备放线菌分离-(2).ppt

一实验目的掌握放线菌的生长特性，微生物的培养方法。掌握微生物实验的基本生物技术了解高氏一号培养基的特点、作用。熟练掌握配制合成培养基的一般方法。实验七高氏一号培养基的制备和土壤中放线菌的分离二实验原理高氏一号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。如果加入适量的抗菌药物，则可用来分离各种放线菌。此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀。因此，混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将两种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。土壤中含有丰富的放线菌，但主要是链霉菌，链霉菌以外的其他放线菌，它们是生物活性物质重要的产生菌三材料与器材１、溶液与试剂可溶性淀粉，NaCI，KNO3，K2HPO4．3H2OMgSO4．7H2O，FeSO4．7H2O，琼脂，1mol/LNaOH,1mol/LHCI。2、仪器与其他用具试管，锥形瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，培养基分装器，天平，高压蒸汽灭菌器，PH试纸，棉花，牛皮纸，麻绳，纱布等盛9ml和4.5ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，无菌培养皿等高氏一号培养基配方如下：可溶性淀粉20gNaCI0．5gKNO31gK2HPO4．3H2O0．5gMgSO4．7H2O0．5gFeSO4．7H2O0．01g琼脂15～25g水1000mlpH7.4～7.6四操作步骤对微量成分FeSO4．7H2O可先配成高浓度的贮备液，按比例换算后再加入。待所有试剂完全溶解后，补充水分到所需的总体积。方法是先在100ml水中加入1gFeSO4．7H2O，配成0.01g/ml的储备液，再在1000ml培养基中加入1ml的储备液。配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的试剂中，在加热融化，最后补充所损失的水分。 2、调pH用试纸测培养基的原始PH,如果偏酸，用滴管向培养基中加入1mol/LNaOH,边滴边搅拌，并随时用pH试纸测其pH,直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCI进行调节。3、分装和加塞将配制的培养基分装入试管内，在试管口或锥形瓶口上塞上棉塞。分离操作步骤4、包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，其外再用一根麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。5、灭菌将上述培养基以1210C,20min,0.103MPa高压蒸汽灭菌。6、搁置斜面将灭菌的试管培养基冷却至500C左右，将试管口端搁在玻璃棒上。斜面的斜度要适当，使斜面的长度约为管长1/3。7、无菌检查将灭菌培养基放入370C的培养箱中培养24～28h，以检查灭菌是否彻底。2.土壤中放线菌的分离

编号，分装：取6套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-3、10-4、10-5）。每个稀释度做两个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷凝至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。另取5支盛有9ml一只盛有10ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。2．稀释倾注分离称10g土样放入90ml无菌水试管中振荡20min，静置30s。用无菌吸管无菌操作取1ml土壤悬液加入到9ml无菌水的大试管中混匀即为10-1的土壤悬液，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6几种稀释度的溶液。（每个稀释度换1支无菌吸管）。3．倒平板分离培养于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的高氏培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固。用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0.2ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应三个平板。用无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。4培养接种完毕，将平皿和试管放入28℃恒温箱培养3~5天，观察平皿上放线菌菌落。