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生物医学实验入门（7）：WesternBlotting（1）蛋白提取

上一讲呢，本侠给大家介绍了大名鼎鼎的PCR，这一讲开始本侠

将要给大家介绍另一项同样大名鼎鼎的实验技术，那就是

WesternBlotting（蛋白质印迹法，后面简称WB）。

上回说PCR的时候，本侠说过，PCR是用来检测某分子在基因水

平的表达情况的，当时本侠还说到了，在一般情况下，我们还需要同

时检测该分子在蛋白水平的表达。今天本侠要讲的WB就是用来检测

蛋白表达的最常用方法，当然喽，之一。

WB的基本原理

如果我们想知道细胞里面有没有表达某种蛋白，用眼睛看，看不

到；用耳朵听，听不到；用手摸，也没法儿摸……桑脑筋没关系，

你没办法触及蛋白，有一种东西可以，那就是抗体！所以WB检测蛋

白的过程说白了就是利用抗体识别蛋白的过程，这就是WB的原理基

础。不仅如此，这也是免疫组织化学（多数情况下）以及流式细胞术

（也是多数情况下）的原理基础。

具体来说，WB是将细胞中的大量蛋白分离后，先利用一种载体

（如一张膜）抓住蛋白，然后用能与该蛋白特异结合的抗体识别蛋白

（这种特性性抗体我们习惯叫做“一抗”，不带任何标记，即抗体上

没有酶也没有荧光），接着再用带有标记的抗体（我们习惯叫“二

抗”）识别一抗。这样一来，三个小盆友手拉手，蛋白拉着一抗，一

抗拉着二抗，所以如果我们有办法检测到二抗，就意味着我们能检测

到蛋白了。童鞋们别忘了刚刚本侠说过，二抗是带有标记的，这个标

记就是用来让蛋白“现形”的法宝。WB中的二抗所带的标记叫做辣

根过氧化物酶（HRP），让蛋白“现形”的时候，只要将HRP的底物

与HRP进行反应即可。

WB的操作步骤

那么WB究竟如何具体操作呢？总的来说，分为五步：蛋白提取、

蛋白电泳、转膜、抗体孵育、显色。具体点地说就是先从组织/细胞中

将总蛋白（我们要检测的蛋白就在其中）提取出来，然后通过电泳的

方法将总蛋白按分子量的大小进行分离（以便抗体识别蛋白），接着

把分离好的蛋白从上步电泳中的胶上转移到便于抗体识别蛋白的载体

上，这个载体就是一种薄膜。一旦蛋白转移到膜上，就可以用抗体识

别蛋白了，所以后面的过程就是用一抗识别（结合）蛋白，再用HRP

标记的二抗识别（结合）一抗，最后用HRP的底物与二抗上的HRP反

应，让蛋白“现形”。

好了，如何做WB，请待本侠一步一步慢慢道来。

第一步：蛋白提取（关键，且做好不容易）

我们要检测的蛋白不是在细胞膜上就是在细胞里面（如果有特殊

要求，需要明确蛋白究竟是在细胞质中还是在细胞核中，还需涉及胞

浆蛋白和胞核蛋白的提取，但是咱们这一讲只说最简单的情况，就是

总蛋白的提取），所以我们提取蛋白第一步需要做的就是瓦解细胞膜，

让蛋白释放出来。瓦解细胞膜常用的是一种叫做RIPA的裂解液，可以

自己配，也可以买现成的，效果差不多，就看你更愿意花钱还是更愿

意花时间。裂解细胞最关键的（本侠多年的经验）有两点：1、裂解的

手法；2、裂解液的用量，本侠在接下来的讲解中会着重提到这两点。

裂解细胞之前先将细胞洗干净。因为在培养细胞的过程中，我们

会用到血清，血清里面有各种各样的蛋白，而我们要测的就是蛋白质

（但是是细胞里的，而不是血清里的），所以为了避免干扰，我们需

要先用PBS将细胞洗两遍。洗细胞这一步操作对于贴壁细胞，可以选

择在收集细胞之前做，也可以选择在收集了细胞以后再做（两者主要

区别在于后者会把原本漂浮在培养基中的死细胞也收集进来，请童鞋

们按需选择），但是对于悬浮细胞来说就没得选了，只能先收集细胞

再洗。如果是收集细胞之前洗的话，就先将原来的培养基弃去，接着

加适量的PBS（童鞋们自己看着加，量多量少无所谓的，只要能起到

洗的作用就行），摇动培养瓶/皿让PBS充分接触细胞