生物技术大实验部分操作程序-易.pdfVIP

生物技术大实验操作指南

注意事项

1、工作服穿戴，禁止吃东西和大声喧哗和串门聊天。

2、用电、气安全注意事项。

3、节约用水，安全用水，有毒、害废水的正确处理。

4、实验室、台卫生，最后离开实验室的同学检查水电门窗。

5、实验报告，正确记录原始数据，分析结果得出合理的结论。

实验一鸡输卵管总RNA提取（溶菌酶基因的提取）

一、原理：组织细胞在冰浴中剪碎（最好有液氮），加Trizol快速匀浆碾磨，加

一定体积的氯仿振荡，离心，取水相，加等体积的异戊醇（或无水乙醇）沉

淀，75%乙醇洗涤，晾干，无RNase的ddHO溶解。

2

二、试剂与设备：TotalRNAExtractor（Trizol）或RNAsimpleTotalRNAKit，

氯仿，异戊醇，无水乙醇，ddHOFreeRNase。研钵，玻璃匀浆器，16000

2

转低温冷冻离心机。

三、步骤：

1、新鲜鸡输卵管膨大部，50mg，预冷的研钵中剪碎，加1mlTrizol冰浴中匀浆，

RT5-10Min。

2、加200ul氯仿，振荡15Sec，RT3Min。

3、4℃12000rpm，离心10Min，吸取上层水相，转入新的离心管。

4、加500ul异戊醇柔和混匀，RT沉淀30Min,离心同上，留取沉淀。

5、加1ml75%乙醇洗涤沉淀2次，勿剧烈振荡，离心同上，收取沉淀，RT晾干

3-5Min。

6、50ulddHOFreeRNase溶解沉淀。

2

7、检测RNA纯度与浓度。

四、结果

五、讨论

1

实验二溶菌酶基因第一链cDNA合成

一、原理：mRNA经M-MuLV催化，以OligodT为引物，将mRNA反转

录合成cDNA，此cDNA为单链。

二、试剂与设备：M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒，恒温水浴锅，掌上离

心机。

三、步骤：

1．在冰浴的试管中加入如下反应混合物：

+

总RNA或Poly(A)RNA或特异性RNAXμg

OligodT(0.5μg/μL)(20pmol)1μL

RNasefreeddH2O定容至12μL

2.轻轻混匀后离心3~5s，反应混合物在65℃温浴5min后，冰浴30s，然后

离心3~5s。

3．将试管冰浴，再加入如下组分：

5×ReactionBuffer4μL

RNaseInhibitor(20U/μL)1μL

dNTPMix(10mmol/L)2μL

M-MuLVRT（200U/μL）1μL

注：若5×ReactionBuffer出现白色结晶，需37℃温浴数分钟至白色结晶完全溶解，

震荡混匀。

4．轻轻混匀后离心3~5s。

5．在PCR仪上按下列条件进行反转录反应cDNA合成42℃30-60min

6.终止反应95℃5min(酶失活)，处理后，置于冰上放置或-20℃保存。

*M-MuLVRT酶最后加。

四、结果

五、讨论

2

实验三鸡溶菌酶基因的PCR扩增

一、原理：利用耐热Taq酶（一种DNA聚合酶），以四种dNTP为底物，

在引物的诱导下，经过变性、退火、延伸三步