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凤仙花坏死斑病毒检疫鉴定方法

SN/T3674—2013

5检症鉴定方法

5.1双抗夹心酶联免疫吸附检测(DAS-ELISA)

将制备的样品汁液用INSVDAS-ELISA试剂盒检测.每个样品设两个重复。同时设刚性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照为同样处理的健康组织汁液，空白对照为样品抽提缓冲液。

具体操作步骤见附录B。

5.2分子生物学检测

注：实际检测中，可视实验室条件选用以下两种方法中任意一种进行。

5.2.1巢式RT-PCR检测

提取样品的总RNA,以RNA为模板反转录合成cDNA,然后以cDNA为模板进行PCR扩增，再将第一次PCR产物稀释后作为模板进行第二次PCR,最后对二次PCR的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。同时设阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照为同样处理的健康组织汁皱，空白对照为超纯水。

具体操作步骤见附录C。

5.2.2实时费光RT-PCR检测

提取样品的总RNA.以RNA为模板反转录合成cDNA,然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR检测。同时设阴性对照，阳性对照和空白对照，阴性对照为同样处理的健康组织汁液，空白对照为超纯水。

具体操作步骤见附录D。

6结果记录与判定

6.1结果记录

DAS-ELISA检测记录各检测反应孔的光密度值，照式RT-PCR检测有电泳结果照片，实时荧光

RT-PCR应有扩增曲线等原始数据。

6.2结果判定

6.2.1样品经DAS-ELISA检测为阴性时，判定样品为风仙花坏死斑病毒阅性。

6.2.2样品经DASELISA检测为阳性、巢式RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阴性时，判定

样品不携带风仙花坏死斑病毒。

6.2.3样品经DAS-ELISA检测为阳性，巢式RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性时，判定

样品携带风仙花坏死斑病毒。

7样品保存

经检验确定携带风仙花坏死班病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。种子保存在干燥条件下，其他的组织样品(如叶片等)保存在—20℃冰箱中，有条件的保存在一80℃冰箱中更好。做好登记和标记工作。

SN/T3674—2013

附录A

(资料性附录)

凤仙花坏死斑病毒相关资料

A.1名称

中文名：风仙花坏死斑病毒

学名：Impatiensnecrotiespotvirus

缩写：INSV

分类地位：布尼亚病毒科(Bunyaviridac),番茄斑萎病毒属(Tospavirus)。

A.2寄主范围

该病毒的寄主范围比较广，自然条件下INSV可侵染50个科300多种植物，其中观赏植物39个属(包括乌头属Acomtitam,六出花属Alstraemeria、银蓬花属Ameo、金鱼草属Antirrhiaun、秋海棠属Begonia、寒丁子属Bovrardia、翠菊属Callistephus、风仙花属Jmpatiens、Colrmmea、大丽花属

Dahlia、菊花Deadranthemaxgrandiforum、紫芳草Exacamaffine、八角金盘Fatsiajaponica、火石

花属Gertera,唐菖蒲属Gladiolws、补血草属Limonium,半边莲属Lohelia,海桐花属Pittasporum,报春花属Priwula、毛莨属Ranaacalus,蝴蝶兰属Phalarmopsis.石斛属Deadrobiam、鸟巢藏Asplewiu

nidws、仙客来Cyrlamenpersitam,洋桔梗Eastomagrandiflorum、瓜叶菊Seweriocrwentws,大岩桐

Sinningiaspeciosa,马蹄莲Zantedeschiaaethiopita,朱顶红HippeastrumAortorum等)。蔬菜6个种

(包括棘椒Capsicamamnara,菊苣Cichorintendicia,黄瓜Cacwissatitws