抗卵清蛋白单克隆抗体的制备及卵清蛋白、醇溶蛋白ELISA检测方法的建立.pdf

谨以此论文献给

默默关心和支持我的人们

秦倩茹抗卵清明

独创声

本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的

研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其

他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含未获得

注翅瀣查墓丝霞要挂剔直塑的:奎拦亘窒或其他教育机构的学位或证书使

用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明

确的说明并表示谢意。

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导

学位论文作者签名:寓拳盘

签字日期:知口年;月日

签字日期:.加/缉乡月夕日?抗卯清蛋白单克隆抗体的制备及卵清蛋白、醇溶蛋白

检测方法的建立

摘要

过敏性疾病影响着全世界近/的人口,其中‰%为食物过敏,被世界

卫生组织列为世纪重点防治的三大疾病之一。年月日,美国国会

通过一项“食品过敏源标签和消费者保护法法案,要求食品生产商

清楚地标明该食品是否含有种最常见的食品过敏原。而在检验检疫系统对进出

口的食品进行常见的大类过敏原蛋、奶、大豆、花生、小麦、树果、鱼和贝

类检测,缺乏相应的标准和方法。本文致力于研究鸡蛋和小麦过敏原的检测方

法,并为制定相应的标准提供理论依据。

卵清蛋白是鸡蛋的主要蛋白质,也是鸡蛋的主要过敏原之一。本文制备了抗

卵清蛋白单克隆抗体,建立了常见过敏原鸡蛋卵清蛋白的检测方法。以

溶解高纯度卵清蛋白,免疫周龄的/小鼠次,直至效价达到弓

之后,再加强免疫次,三天后取小鼠脾细胞与/骨髓瘤细胞经融合,

经间接和有限稀释法筛选,获得了株分泌抗卵清蛋白单克隆抗体的杂交

瘤细胞株,分别是.、.、.、.、.、

.,培养上清效价分别为:、:、:、:、:、

:,细胞冻存复苏后效价不变;一的亚型是,.和

.是,.、.和.的亚型是;与、

猪血清、兔血清均没有交叉反应。选取其中抗体效价最高的两株杂交瘤细胞

和,制备腹水以及纯化,纯化后的抗体分别与偶联。将偶

联成功的抗体作为酶标抗体,一作为包被抗体,经方阵滴定法确

定最适的包被抗体浓度是:和酶标抗体工作浓度是:,在最适浓度下

优化双抗体夹心测卵清蛋白的条件。利用优化后的试验条件进行

双抗体夹心法检测,建立卵清蛋白的标准曲线。检测的最佳线性范围是

.//,.,最低检测限度为./,大约.。在

同一次实验内,样品的回收率在.%.%之间,精密度为.%.%,次试验间精密度为.%.%。可在。放置

一个月。与

鸡肉、猪肉、牛肉无交叉反应,对鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋中的卵清蛋白具有特异性。

自制的试剂盒与成品试剂盒检测实际样品进行比较结果基

本相符,并且检出灵敏度为成品试剂盒的倍。

醇溶蛋白是小麦等谷物类的主要过敏原,约占小麦种子贮藏蛋白总量的

%,因此可以作为小麦的检测指标,本文建立常见过敏原小麦醇溶蛋白的

检测方法。以%乙醇溶解公司的小麦醇溶蛋白免疫/小鼠,免疫

血清作为阳性对照。以鼠抗醇溶蛋白单抗为包被抗体,标记兔抗醇溶蛋白多

抗为酶标抗体,以方阵滴定法确定包被抗体的包被浓度是/和酶标抗体的

最适工作浓度是:,在最适浓度下选择合适的封闭液,即含%胎牛血清的

,建立双抗体夹心法检测醇溶蛋白,拟合标准曲线并制备醇溶蛋白试

剂盒。检测的最佳线性范围是.~/,逊.,最低检测限为

./,对应的食品样品检测限为.。样品的回收率在.%.%

之间,试验内为./.%,试验间为.%~.%,对大麦有一定

的交叉反应性,可在℃放置两周,稳定性较好。

本文分别建立了卵清蛋白定量和醇溶蛋白定量检测方法。准确度、

精密度和稳定性均较高。其中卵清蛋白检测试剂盒定量检出灵敏度是进

口产品的倍,检测费用大约只有进口产品的一半,试剂盒的技术参数优于或

达到国外同类产品的水平,能满足日常进出口检测的要求,并为国内制定相应的

方法和标准奠定了理论基础。

关键词:单克隆抗体;卵清蛋白;醇溶蛋白;检测方法一●一■■■■■●■■

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