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原核表达课件
2024-01-28
contents
目录
原核表达概述
基因克隆与载体构建
原核细胞培养与转化
蛋白质诱导表达与纯化
蛋白质鉴定与功能分析
实验设计与数据分析
CHAPTER
原核表达概述
01
利用原核生物（如细菌）作为宿主细胞，通过基因工程技术将外源基因导入原核细胞，并使其在细胞内表达产生目标蛋白的过程。
原核表达定义
原核表达基于基因重组技术，将目的基因与表达载体连接，构建成重组质粒，然后转化至原核细胞中。在原核细胞内，重组质粒上的目的基因得以表达，产生目标蛋白。
原理
表达载体
宿主细胞
转化方法
培养基和培养条件
01
02
03
04
用于携带和表达目的基因的DNA分子，通常包括复制起点、选择标记和表达元件等。
用于接受和表达重组质粒的原核细胞，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。
将重组质粒导入宿主细胞的方法，如化学转化、电转化等。
用于培养宿主细胞和诱导目标蛋白表达的培养基和培养条件。
原核细胞生长迅速，可短时间内获得大量目标蛋白。
快速、高效
原核细胞培养条件简单，无需昂贵设备和试剂。
成本低廉
适用于多种蛋白：原核表达系统可用于表达多种类型的蛋白，包括酶、抗体、激素等。
原核细胞表达外源蛋白时，表达水平可能受到多种因素影响，如宿主细胞状态、培养条件等。
表达水平不稳定
缺乏翻译后修饰
内毒素问题
原核细胞无法对表达的蛋白进行复杂的翻译后修饰，如糖基化、磷酸化等。
部分原核细胞表达的蛋白可能具有内毒素活性，影响蛋白的纯化和应用。
03
02
01
CHAPTER
基因克隆与载体构建
02
利用特异性引物对目的基因进行PCR扩增，得到目的基因片段。
PCR扩增法
利用限制性内切酶切割DNA分子，得到具有黏性末端的DNA片段，再通过连接酶连接成完整的DNA分子。
限制性内切酶法
将目的基因与载体DNA在体外进行重组，形成重组DNA分子，然后转化到受体细胞中进行扩增。
重组法
质粒载体
具有自主复制能力的小型环状DNA分子，常用于原核生物的基因克隆与表达。
噬菌体载体
以噬菌体为基础构建的载体，可整合到宿主菌染色体上，用于高通量基因克隆与表达。
病毒载体
以病毒为基础构建的载体，可感染宿主细胞并将目的基因导入细胞中进行表达。
重组质粒构建
重组质粒鉴定
转化与筛选
表达检测
将目的基因与载体DNA进行体外重组，形成重组质粒。
将重组质粒转化到受体细胞中，通过选择性培养基筛选阳性克隆。
通过PCR、酶切、测序等方法对重组质粒进行鉴定，确保目的基因已正确插入到载体中。
对阳性克隆进行诱导表达，检测目的蛋白的表达情况。
CHAPTER
原核细胞培养与转化
03
根据原核细胞生长需求，选择适当的培养基，如LB培养基、TB培养基等。
原核细胞培养温度一般为30-37℃，需根据具体菌种调整。
摇床转速影响细胞生长和氧气供应，一般设置为180-250rpm。
根据细胞生长速度和实验需求，确定培养时间，一般为12-48小时。
培养基选择
培养温度
摇床转速
培养时间
利用化学物质如CaCl2、MgCl2等处理细胞，使其处于感受态，再与DNA接触实现转化。
化学转化法
通过高压电脉冲在细胞膜上形成瞬时通道，使DNA进入细胞。
电转化法
利用基因枪将DNA包裹在金属微粒上，高速轰击细胞实现转化。
基因枪法
细胞处于对数生长期时，转化效率较高。
细胞状态
DNA质量
转化方法
转化条件
纯度高、无污染的DNA有助于提高转化效率。
不同转化方法适用于不同类型的原核细胞，需根据具体情况选择。
如化学转化中的处理时间、温度等，电转化中的电压、电容等参数，均会影响转化效率。
CHAPTER
蛋白质诱导表达与纯化
04
物理诱导剂
温度、pH等，通过改变细胞内外环境，影响蛋白质的稳定性或酶活性，进而调控基因表达。
化学诱导剂
IPTG等，通过与阻遏蛋白结合使其构象改变，从而解除对操纵子的阻遏作用，启动基因表达。
生物诱导剂
特定代谢物或信号分子，与细胞内受体结合后，通过信号转导途径激活或抑制基因表达。
03
培养基成分
培养基中的碳源、氮源、无机盐等成分对蛋白质表达有影响，需调整培养基配方以提高表达效率。
01
诱导剂浓度
不同浓度的诱导剂对蛋白质表达的影响不同，需通过实验确定最佳浓度。
02
诱导温度和时间
温度和时间影响蛋白质的稳定性和产量，需根据实验需求进行优化。
层析法
电泳法
超滤法
沉淀法
利用不同物质在固定相和流动相之间的分配系数不同而实现分离，包括凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等。适用于不同大小和电荷的蛋白质的分离纯化。
利用蛋白质在电场中的迁移率不同而实现分离，包括SDS、Native等。适用于不同大小和电荷的蛋白质的分离纯化，特别适用于鉴定蛋白质的纯度。
利用超滤膜对不同大小分子的截留作用而实现分离，适用
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