载体与宿主的选择.ppt

5.2酵母人造染色体（YeastArtificialChromosomesYAC）YAC载体应含有下列元件：酵母染色体的端粒序列酵母人造染色体的构建：pYAC4CEN4EcoRIURA3TELBamHITELoriAprTRP1ARS1酵母染色体的复制子酵母染色体的着丝粒序列酵母系统的选择标记大肠杆菌的复制子大肠杆菌的选择标记YAC载体的装载量为350-400kb第63页，课件共84页，创作于2023年2月3噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为：高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增第31页，课件共84页，创作于2023年2月3.1大肠杆菌的l噬菌体3.1.1l噬菌体的生物学特性：生物结构l噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成l-DNA全长48502个核苷酸l-DNA上至少有61个基因第32页，课件共84页，创作于2023年2月l噬菌体生物学特性：生物结构5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNA第33页，课件共84页，创作于2023年2月l噬菌体生物学特性：感染周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解第34页，课件共84页，创作于2023年2月l噬菌体生物学特性：感染周期体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75-105%即36-51kbDA第35页，课件共84页，创作于2023年2月l噬菌体生物学特性：溶原状态l噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶原状态DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态第36页，课件共84页，创作于2023年2月3.1.2l-DNA载体的构建：野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型l-DNA的长度，可以提高装载量。其实野生型l-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除的多少，可将l-DNA分成两大类载体：插入型载体取代型载体DNA大小是野生噬菌体的75-105%(37-51kb)，才能被包装成噬菌体（1）缩短长度第37页，课件共84页，创作于2023年2月l-DNA载体的构建：缩短长度插入型载体体外包装插入位点体外包装插入片段载体长度37kb插入片段大小：0-14kb（51–37）第38页，课件共84页，创作于2023年2月l-DNA载体的构建：缩短长度取代型载体体外包装体外包装插入片段最小装载长度10kb（36–51）载体长度26kb插入片段最大装载长度25kb第39页，课件共84页，创作于2023年2月（2）删除重复的酶切位点野生型的l-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1-2个同时，为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点第40页，课件共84页，创作于2023年2月（3）加装选择标记与质粒不同，野生型l-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是l-DNA克隆载体构建的重要内容l-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类：免疫功能类标记颜色反应类标记第41页，课件共84页，创作于2023年2月加装选择标记imm434imm434基因编码一种阻止l-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的l-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；