多酶级联催化γ-丁内酯合成1,4-丁二醇.pdf

摘要

摘要

1,4-丁二醇（1,4-BDO）作为一种大宗性的商品化学品，主要用作溶剂以及增湿剂，

其衍生物可应用于化工合成、医药和化妆品等领域。而目前还未在生物体发现天然合成

1,4-丁二醇的途径。本论文基于多酶级联催化方法，构建了一条以γ-丁内酯（GBL）为

底物生产1,4-丁二醇的路径。γ-丁内酯作为底物虽然不具有直接的经济性，但是该路径

的实施主要是为后续以葡萄糖为底物构建1,4-丁二醇及其高附加值衍生物合成路径提供

基础支撑。该路径首先利用己内酯水解酶（ChnC）将γ-丁内酯水解开环生成4-羟基丁酸

（GHB），接着在羧酸还原酶（Car）、醇脱氢酶（YqhD）的作用下，将4-羟基丁酸两

+

步还原成生成1,4-丁二醇；同时引入甲酸脱氢酶（FDH）构建了NADH/NAD辅酶循环

再生系统。最终在上述4种酶的共同催化作用下实现了利用酶法高效生产1,4-丁二醇。

主要研究结果如下：

（1）将来源于红球菌（Rhodococcussp.TK6）的Rschnc、来源于海洋分枝杆菌

（Mycobacteriummarinum）的Mmcar以及来源于大肠杆菌（EscherichiacoliK12MG1655）

的Ecyqhd三种关键酶基因分别在E.coliBL21中成功克隆表达。酶学性质分析表明：

ChnC的比酶活为0.95U·mg-1，最适反应温度范围在35-40℃，在pH7.0-9.0范围内具有

较高的催化活性；Car的比酶活为0.28U·mg-1，最适反应温度在30℃附近，在pH7.0-

8.0附近具有较高的催化活性；YqhD的比酶活为0.43U·mg-1，最适反应温度范围30-

37℃，在pH7.0附近具有较高的催化活性。

（2）利用半理性设计的方法对ChnC酶蛋白进行稳定性改造，通过引入二硫键得到

一株半衰期显著延长的突变体S1，有益突变点为K166C和A197C。该突变体在30-37℃

条件下，半衰期由20h左右变成35h左右，提升1.75倍；在pH7和8处相较于野生型

半衰期也提升了20h左右。其次针对转化过程中关键限速酶Car进行了设计改造，分别

使用RBS序列优化和分子对接手段，最终得到突变体N1，其催化能力显著提高，在相

同条件下的转化效率是野生型Car的2倍左右，有益突变点为A882H。

（3）优化了多酶级联反应的生产工艺。在30℃、pH7.0、关键酶酶活力（U·mL-1）

添加量比例为1:3:2（ChnC:Car:YqhD），γ-丁内酯添加量为5gL-1，反应时间60h，

1,4-丁二醇产量达到2.41gL-1，摩尔转化率为46.1%，产量与最初优化前相比提高至

375.4%。在使用突变体S1以及N1后，反应60h，1,4-丁二醇产量达到3.22gL-1，摩尔

转化率为60.1%，产量相较于野生型提升至133.6%。

（4）为了增加1,4-丁二醇的产量，采用底物流加策略。在不进行底物补加的情况下，

使用突变体S1以及N1时，最终获得4.36gL-1的1,4-丁二醇，产量为野生型的123.9%，

摩尔转化率达到80.6%；在有底物流加时，1,4-丁二醇产量最高达到9.16gL-1，提升至

野生型的145.2%，但是摩尔转化率仅为56.5%。在此基础上，继续延长反应的时间，最

终1,4-丁二醇的积累量达到了12.97gL-1，产量相较于延长反应之前提升41.6%，摩尔

转化率也提升至61.9%。

关键词：1,4-丁二醇；γ-丁内酯；多酶级联催化；辅酶循环再生；分子改造

Abstract

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Asabulkcommoditychemical,1,4-butanediol(1,4-BDO)