产甘油假丝酵母盐胁迫抗逆基因筛选及应用.pdf

摘要

摘要

微生物在生长和工业发酵应用中面临多种环境压力，改善微生物盐胁迫压力耐受性

对于发酵中成本控制、工艺优化及发酵产量提高具有重要意义。产甘油假丝酵母

（Candidaglycerinogenes）是一株具有多重抗逆性能的工业菌株，但其抗逆机制和抗逆

基因元件的挖掘仍不充分。本论文基于课题组前期研究，以C.glycerinogenes为对象，

挖掘盐胁迫抗逆基因，并对其抗逆机制和应用进行初探，主要内容如下：

挖掘C.glycerinogenes盐胁迫压力响应基因。基于胁迫下C.glycerinogenes转录组

数据，选取七个上调基因作为潜在的抗逆基因。分别在酿酒酵母（Saccharomyces

cerevisiae）过表达和在C.glycerinogenes反义抑制基因表达，发现DNA损伤检查点蛋

白基因Cgrad9和RNA解旋酶基因Cgdbp7对盐胁迫耐受性有影响。盐胁迫下，过表达

Cgrad9后，S.cerevisiae生物量提高22.8%，抑制Cgdbp7表达后，C.glycerinogenes生

物量提高12.6%，表明Cgrad9是盐胁迫抗逆基因，而Cgdbp7作为负调控因子在盐胁迫

中发挥作用。

对上述基因的盐胁迫压力响应机制进行初步探究。重组菌膜性质分析发现，过表达

Cgrad9或抑制Cgdbp7表达后，S.cerevisiae膜流动性和通透性未发生明显变化，C.

glycerinogenes膜流动性降低。RT-qPCR发现，盐胁迫下重组S.cerevisiae和重组C.

glycerinogenes中离子转运蛋白nhx1的转录水平分别提高2.2倍和26.6倍。酵母单杂交

筛选发现，转录因子Upc2能够结合Cgrad9启动子序列。以上结果表明Cgrad9和Cgdbp7

通过影响重组菌膜流动性、离子转运蛋白转录水平改善重组菌盐胁迫耐受性。同时，转

录因子Upc2与Cgrad9启动子序列结合，是Cgrad9潜在的调控因子。

将过表达菌株和反义抑制菌株应用于高盐环境和未脱毒纤维素水解液的发酵。高盐

环境下，过表达Cgrad9后，菌株生物量较对照提高22.8%，乙醇产量提高17.3%。反义

抑制重组菌株发酵结果显示，生物量较对照提高25.8%，乙醇产量为39.0g·L-1，提高

46.1%。将反义抑制重组C.glycerinogenes应用于未脱毒纤维素水解液发酵，生物量较对

照提高8.2%，乙醇产量为22.8g·L-1，提高13.7%。转录分析发现未脱毒纤维素水解液

下，乙醇脱氢酶adh1转录上调，可能提高反义抑制重组菌株糠醛耐受性，使得反义抑

制重组菌生物量提高，进而提高乙醇产量。以上结果表明过表达Cgrad9或抑制Cgdbp7

表达能够改善重组菌在高盐及复杂环境胁迫下的发酵水平，可为酵母抗逆机制研究和应

用提供借鉴。

关键词：产甘油假丝酵母；压力响应基因；盐胁迫；过表达；反义抑制

Abstract

Abstract

Microorganismsfacemultipleenvironmentalstressesingrowthandindustrial

fermentationapplications,andimprovingmicrobialsaltstresstoleranceisimportantforcost

control,processoptimizationandfermentationyieldimprovement.Candidaglycerinogenesis

anindustrialyeaststrainwithmultiplestresstoleranceproperties,butitsstresstolerance