Thermotoga_pe...向异构酶热稳定性改造及应用.pdf

摘要

摘要

D-塔格糖作为稀少糖，除了具有热量低、口感好等特点外，还具有零血糖生成指

数、益生元作用等生理学功能，已成为当下研究热点。目前主要通过化学法和生物法

合成D-塔格糖，而现有生物法具有成本高、转化率受限等缺点。因此，寻找高效其它

途径合成D-塔格糖极具研究意义和应用价值。D-果糖是D-塔格糖C-4位的差向异构体，

价格低廉，是生产D-塔格糖的理想底物，因此，寻找能催化D-果糖合成D-塔格糖的新型

酶成为破除D-塔格糖合成壁垒的关键。

石油热袍菌(Thermotogapetrophila)来源塔格糖酮酸3-差向异构酶(Tagaturonate3-

epimerase)经分子改造后，能以D-果糖为底物合成D-塔格糖，其改造后被命名为塔格糖

4-差向异构酶(Tagatose4-epimerase，T4E)。本研究以T4E为研究对象，对其重组表达，

全细胞固定化进行探究，后续通过理性设计与定向进化策略对其进行热稳定性改造，

并对获得的优势突变体进行酶学定性与应用效果探究，为T4E的工业化应用奠定了基

础。

本论文主要研究结果如下：

(1)T4E在大肠杆菌中的重组表达、酶学性质测定及全细胞固定化研究。通过在T4E

的N端融合T7tag，成功实现其在E.coli中的重组表达，测定了其酶学性质，并对其全细

胞固定化进行探究。结果显示，T4E的最适pH为8.5，最适温度为70℃，在该温度下半

-

衰期为2.9h。对全细胞固定化条件进行优化，最优条件为：海藻酸钠浓度(1%，w·v

1-1-1-1

)、细胞包埋量(75g·L)、CaCl2浓度(2%，w·v)、硅藻土浓度(1.5%，w·v)，在该条

件下，固定化细胞的酶活回收率为66.7%。

(2)理性设计提高T4E热稳定性。通过软件分析预测、T4E结构分析并结合B-因

子、自由能(∆G)等参数进行突变预测，根据二硫键策略构建了突变体I120C/G157C、

A93C/L117C以及T276C/L300C：根据B-因子策略构建了突变体D213E、D250V、

E322H以及E334G。分别测定了突变体的热稳定性与比活力，其中，突变体E322H热稳

定性显著提高，但其比活力有一定程度的下降，酶转化结果显示其转化率低于野生

型。结果表明，通过理性设计策略对T4E进行热稳定性改造目前尚存在一定的难度，后

续需要寻找其它手段对T4E进行热稳定性改造。

(3)定向进化提高T4E的热稳定性。构建了新型T4E高通量筛选方法，并用于T4E突

变文库的高通量筛选，筛选获得了热稳定性显著提高的突变体I430P，以该突变体为亲

本进行第二轮筛选，获得了比活力显著提高的突变体G90S/T272A/I430P，并对突变体

进行了酶学性质测定与应用效果探究。突变体I430P半衰期(t1/2)为野生型的1.83倍，解

折叠温度(T)较野生型提高了5.1℃，突变体G90S/T272A/I430P其比活力较野生型提高

m

了21.4%，半衰期(t)为野生型的1.69倍，解折叠温度(T)较野生型T4E提高了3.4℃。

1/2m

突变体I430P、G90S/T272A/I430P的酶转化应用效果与固定化应用效果均优于野生型。

摘要

关键词：塔格糖4-差向异构酶；大肠杆菌重组表达；全细胞固定化；热稳定性；分子

改造

Abstract

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D-tagatose,asararesugar,noto