多酶级联转化L-对羟基苯甘氨酸生产D-对羟基苯甘氨酸的研究.pdf

摘要

摘要

非蛋白源性氨基酸D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)是一个重要的砌块，在制药工

业中用于生产阿莫西林、青霉素和头孢菌素等。目前已经开发了几种有效的合成

方法包括：化学法和酶法。化学法合成外消旋体DL-HPG，然后动力学拆分获得

D-HPG；其中L-HPG被丢弃造成了原料浪费。而酶法中的双酶(Hase和Case)级联

转化存在底物溶解度低和产率低等问题。本研究中，我们构建了一条以DL-HPG

为底物的三酶级联路径生产D-HPG；并通过蛋白质工程改造提高DAPDH酶的催

化活性。最后通过转化条件优化，实现了D-HPG的高效合成。主要研究结果如下：

(1)生产D-HPG级联路径的设计、构建以及验证。首先，我们设计一条以DL-

HPG为底物的三酶级联路径生产D-HPG。接着，筛选到Escherichiacoli来源的芳

香族氨基酸氨基转移酶(EcAroAT)、Prevorellatimonensis来源的二氨基庚二酸脱

氢酶(PtDAPDH)以及Bacillismegaterium来源的葡萄糖脱氢酶(BmGDH)，用作路

径酶催化反应。随后，通过体外催化反应检测到产物生成，经阳离子质谱鉴定验

证了路径的可行性。最后，三个酶体外的催化活性比，确定了低活性的PtDAPDH

是级联反应的限速酶。

(2)PtDAPDH的蛋白质结晶和结构机制解析。首先，重组菌株E.coli-pET28a-

PtDAPDH表达纯化后利用商业化晶体筛选试剂盒进行结晶条件的筛选，获得分

辨率分别为2.47Å的空蛋白(PDB：8HP0)和3.07Å的蛋白-辅酶NADPH复合物

晶体(PDB：8HP3)；随后进行晶体二级结构分析，并根据分子对接模型进行

关键残基功能的突变验证；最后推测出还原胺化机制。

(3)理性设计提高PtDAPDH的催化活性。基于晶体结构和催化机制分析，提

出“重塑结合口袋和构象”的策略进行蛋白质工程改造。获得的最优突变体

PtDAPDHM4(W121V/H227I/R181T/S70D/S160R)相对于野生型，酶活提高了25.6倍，kcat/Km提

高了26.57倍；蛋白结构比较及MD模拟显示：(i)底物结合口袋的扩大，缩短了底

物与NADPH之间氢化物转移距离；MD模拟表明突变体活性位点周围的氢键网络

比野生型更广泛。(ii)残基S72D与S160R突变后，形成额外的作用力增强了域间相

互作用网络，增加了闭合态构象分布。

(4)三酶级联组装全细胞生产D-HPG。用PtDAPDHM4替换路径中的

PtDAPDH，转化实验表明还原胺化HPGA这一限速步骤被消除。随后进行转化条

件的优化后，将反应放大至3L发酵罐，10h内可以转化40g·L-1DL-HPG生成19.8

g·L-1D-HPG，总滴度为39.8g·L-1，转化率为49.5%，ee99%。

关键词：D-对羟基苯甘氨酸；内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶；催化机制；蛋白质

工程；多酶级联

I

Abstract

Abstract

Thenon-proteinogenicaminoacidD-p-hydroxyphenylglycine(D-HPG)isan

importantbuildingblockusedinthepharmaceuticalindustryfortheproductionof

amoxicillin,penicillin,andcephalosporin.Severalefficientsynthesismethodshave

beendeveloped,includingchemicalandenzymaticmethods.Chemicalmethods

typicallysynthesizeracemateDL-H