多酶级联转化L-DOPA生产羟基酪醇的研究.pdf

摘要

摘要

橄榄来源的天然酚类化合物羟基酪醇，因其强抗氧化活性和抗癌保护特性而对人体

有益，被广泛的应用于食品，医药保健品和化妆品等领域。目前报道的化学合成和天然

提取获得羟基酪醇的方法仍存在较多的不足，相对而言，生物转化法具有绿色可持续，

反应工艺简单，底物特异性高，不依赖于金属催化剂等优点，逐渐成为合成天然产物羟

基酪醇的有利工具。在这项研究中，我们设计并重建了一条新型的四酶级联系统，将L-

氨基酸氧化酶（LAAD）、α-酮酸脱羧酶（PmKDC）、醛还原酶（YahK）和葡萄糖脱氢酶

（GDH）的基因共同于EscherichiacoliBL21(DE3)内表达，使3,4-二羟基苯基丙氨酸（L-

DOPA）依次通过脱氨、脱羧和还原反应最终转化为羟基酪醇。GDH的作用则是催化葡

萄糖脱氢以实现辅因子NADH的再生，而NADH是YahK催化合成羟基酪醇必需的氢

供体。随后采取不同拷贝数质粒组合的策略来协调途径内酶的表达，以实现LAAD，

PmKDC，YahK和GDH在级联反应中发挥出较好的协调性。本论文主要研究内容及结

果如下：

（1）多酶级联途径内酶的选择和体外验证。采用实验室前期筛选的来源于

Cosenzaeamyxofaciens的LAAD；来源于ProteusmirabilisJN458的PmKDC；来源于

EscherichiacoliBL21的YahK和来源于BacillussubtilisATCC13952的GDH作为级联

路径的酶催化剂。首先使用LAAD，PmKDC，YahK和GDH的酶提取液进行体外级联

反应，HPLC法检测羟基酪醇的产生情况，证明了级联路径的可行性。

（2）共表达E.coli重组工程菌株的构建及酶的表达水平优化。将aadL，pmkdc，

yahk和gdh基因以双质粒共同表达的策略整合于E.coliBL21(DE3)内，以调节酶的相对

活性同时平衡反应速率。成功构建了9株重组菌，确定PmKDC为本途径最主要的限速

酶，最终9株菌株中HTG7(E.coliBL21(DE3)/pRSF-aadL-pmkdc-yahk/pET-gdh)内的各

酶表达协调性最佳，全细胞催化剂在4h内催化生成的羟基酪醇的最高产量为36.40

mmol·L-1。

（3）对重组菌株培养和转化条件进行系列优化。确定最优培养基组成为：15g·L-1

甘油，25g·L-1酵母膏，20g·L-1蛋白胨，1.5g·L-1硫酸镁，2.2g·L-1磷酸二氢钾，9.4g·L-

1磷酸氢二钾；最优诱导表达条件为：开始诱导的菌体浓度OD600为0.8，IPTG诱导浓度

-1+-1

为0.4mmol·L，诱导温度为20℃；最优转化条件为：NAD浓度为0.3g·L，温度为

30℃，pH为7.0，湿菌体浓度为35g·L-1，转速为200r·min-1。经系列优化后，羟基酪醇

的产量提升至45.27mmol·L-1。随后，最适条件下，在5L发酵罐内扩大生产羟基酪醇，

最终在8h内从60.91mmol·L-1的L-DOPA合成了56.85mmol·L-1（8.75g·L-1）的羟基酪

-1-1

醇，时空生产率为1.1g·L·h。最后利用乙酸乙酯多次萃取反应液，有机相经旋转蒸发

仪蒸馏后得到色谱纯度较高的羟基酪醇，乙酸乙酯对羟基酪醇的萃取率高达95.9%。

关键词：羟基酪醇；L-DOPA；多酶级联转化；全细胞催化；质粒模块化组合；

Abstract

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Hydroxytyrosol,aphenolicco