地衣芽孢杆菌异源重组系统的构建及应用.pdf

摘要

摘要

地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）具有蛋白分泌能力强、胞外酶产量高、发酵

条件简单等诸多优良特性，因此是非常具有应用前景的工业微生物之一。当前菌种选育

的主要方式为自然筛选和传统诱变，但地衣芽孢杆菌过低的内源重组效率极大地限制了

对它的遗传改造，并且由于缺乏高效的基因编辑工具，地衣芽孢杆菌应用的进一步拓展

受到限制。近年来，噬菌体重组系统已经被应用于提高许多细菌的重组效率，但目前尚

未报道一种可有效应用于地衣芽孢杆菌的噬菌体重组系统。本研究向地衣芽孢杆菌内引

入噬菌体来源的RecT重组酶，利用鼠李糖启动子作为表达元件在地衣芽孢杆菌中构建

了条件表达的重组系统，敲除α-淀粉酶基因验证了该系统的基因编辑功能，并且通过操

作条件的优化在一定程度上提高了该重组系统基因编辑的效率。主要内容和结果如下：

(1)重组酶及其表达元件的挖掘：选择芽孢杆菌及其噬菌体来源的重组酶编码基因，

通过氨基酸同源性比对和系统发育进化树的分析，确定了5个既具同源性又具多样性的

RecT家族重组酶。基于代谢途径的分析发现鼠李糖操纵子，由3个特征基因鼠李糖醛

缩酶基因yuxG、鼠李糖激酶基因yulC及其转录调节因子yulB组成。挖掘得到鼠李糖操

纵子中的启动子Prha，以绿色荧光蛋白作为报告基因探究了不同条件下Prha启动子转录

表达特性，得出地衣芽孢杆菌内源鼠李糖启动子是由鼠李糖严格控制的诱导型启动子，

并且基因的转录表达随着鼠李糖浓度的升高而增强。

(2)重组系统的构建及功能验证：利用鼠李糖表达元件Prha和5个异源的噬菌体同

源重组酶构建重组系统。建立了基于该重组系统的基因编辑方法为以pHY300-PLK为载

体，携带重组酶表达盒与目的基因敲除盒构建成敲除质粒。敲除质粒电转化至地衣芽孢

杆菌后诱导重组酶的表达以进行同源双交换实现目的基因的敲除，后续以无抗传代的方

式丢失敲除质粒。通过敲除α-淀粉酶amyL基因鉴定5个重组酶的功能，发现来自Bacillus

phage049ML001的RecT重组酶在地衣芽孢杆菌中的重组功能较显著，以其构建的重组

系统将地衣芽孢杆菌的重组效率提高至5.56%。

(3)重组系统的操作条件优化：分别优化了鼠李糖添加时间、添加浓度、菌株培养

时间以及传代次数等操作条件。得出在敲除α-淀粉酶基因amyL时，生长8h后添加1.5%

的鼠李糖诱导重组酶RecT表达，继续培养24h、传代3次后基因编辑效率最高，达到

16.67%。同时以片段的形式进行重组底物的敲入，在这一过程中发现地衣芽孢杆菌会发

生随机整合事件。

(4)重组系统的应用：应用重组系统敲除地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶aprE基因和磷酸

转移酶系统中的关键基因。成功敲除了碱性蛋白酶aprE基因，敲除效率为12.5%；但磷

酸转移酶系统关键基因的敲除仍存在困难。

关键词：地衣芽孢杆菌；RecT重组酶；同源重组；基因编辑；鼠李糖启动子

Abstract

Abstract

Bacilluslicheniformishasmanyexcellentcharacteristics,suchasstrongproteinsecretion

ability,highextracellularenzymeproduction,andsimplefermentationconditions.Therefore,it

isoneofthemostpromisingindustrialmicroorganisms.Currently,themainmethodsofstrain

selectionarenaturalscreeningandtraditionalmutagenesis,butlowendogenousrecombination

efficiencyofB.licheniformisgreatlylimitsitsgeneticmodification.Moreover,dueto