产中性乳糖酶乳酸克鲁维酵母的筛选与菌种改良.pdf

摘要

摘要

中性乳糖酶（Lactase）能够水解乳糖分子中的β-半乳糖苷键，将乳糖水解成半乳

糖和葡萄糖，主要应用于低乳糖乳制品生产。乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyceslactis）

是生产中性乳糖酶的主要菌株。然而，目前乳酸克鲁维酵母所产中性乳糖酶产量较低

且为胞内酶，限制了中性乳糖酶的推广应用。因此，本论文比较不同产乳糖酶乳酸克

鲁维酵母并测定其酶学性质，选择酶活性最高的菌株K.lactisJNXR-2101作为底盘细胞。

进一步建立基于荧光底物4-甲基伞形酮-β-D-半乳糖苷(4-methylumbelliferyl-β-D-

galactopyranoside,MUGal)的高通量筛选方法，通过诱变筛选获得了一株乳酸克鲁维酵

母突变菌株K.lactisJNXR-2101-7A。同时，为简化胞内乳糖酶的释放，利用

CRISPR/Cas9技术敲除甘露糖蛋白E01057g基因，构建乳酸克鲁维酵母裂解工程菌。主

要研究结果如下：

（1）产中性乳糖酶乳酸克鲁维酵母出发菌株比较与酶学性质测定，选择K.lactis

JNXR-2101、JNXR-2102为底盘菌株。首先测定十株实验室保存的乳酸克鲁维酵母的生

长曲线和中性乳糖酶产量，选择高产中性乳糖酶的菌株测定乳糖酶酶学性质。K.lactis

GG799、JNXR-2101、JNXR-2102所产乳糖酶的最适反应温度为45℃，其中GG799热

稳定性较差，45℃保温15min残余酶活仅为46%；GG799、JNXR-2101、JNXR-2102的

最适反应pH为9，其中GG799、JNXR-2101在pH为6.5-8之间时较为稳定，JNXR-

2102在pH6~8.5之间比较稳定。

（2）产中性乳糖酶乳酸克鲁维酵母JNXR-2101和JNXR-2102的发酵过程优化，

摇瓶中JNXR-2101乳糖酶产量较高为90.20U·mL-1，5L发酵罐中乳糖酶产量为228.82

U·mL-1。首先进行单因素实验，测定碳源、氮源、无机盐离子、生长因子等对中性乳

糖酶活性的影响。依据单因素实验结果，设计正交优化实验（L16_4_5）确定JNXR-

2101最优发酵培养基为乳糖40g·L-1、玉米浆40g·L-1、复合氮源50g·L-1、MnSO0.3

4

g·L-1和MgSO0.5g·L-1。使用此培养基，JNXR-2101的最适发酵条件为pH5.0、培养

4

温度30℃、转速220rpm，中性乳糖酶产量为90.20U·mL-1，比初始条件提高了5.54倍。

在5L发酵罐中进行分批补料发酵，中性乳糖酶产量为228.82U·mL-1。

（3）基于荧光底物MUGal建立高产中性乳糖酶菌株的高通量筛选方法，通过常

温常压等离子体诱变技术处理出发菌株，借助96孔板筛选获得一株高产乳糖酶突变株

JNXR-2101-7A。JNXR-2101-7A摇瓶中乳糖酶产量为17.15U·mL-1，提高了64.79%。5

L罐JNXR-2101-7A乳糖酶产量为180.05U·mL-1，单位OD的乳糖酶产量为0.91

U·(OD·mL)-1高于野生型菌株0.66U·(OD·mL)-1。

（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除K.lactis中推定的细胞壁甘露糖蛋白基

因（E01057g），构建裂解工程菌K.lactisJNXR-2101ΔE01057g。使用5U·mL-1裂解酶

Lyticase处理30min，中性乳糖酶的释放量可达到与使用FastPrep-24破壁方式相似的蛋

白释放效果，有效简化胞外中性乳糖酶的制备过程。

关键词：乳酸克鲁维酵母；中性乳糖酶；发酵优化；高通量筛选；蛋白分泌

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