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摘要
摘要
随着人口老龄化趋势日益加剧,作为一种与增龄密切相关的疾病,骨质疏松症及其
[1]
所致骨折已成为严重危害老年人生命质量的重大公共卫生问题。预防骨质疏松症的发
展和干预措施能否对于减少骨折的发生,促进健康老龄化,减轻社会负担具有重要意义。
骨质疏松症与成骨细胞介导的骨形成下降和破骨细胞介导的骨吸收亢进密切相关。由于
抗骨吸收药无法改善骨骼完整性以及存在严重负作用,深入研究成骨细胞分化调控机制
并开发促骨形成干预措施是当前骨质疏松防治研究领域的重点。组蛋白修饰是重要的表
观遗传调控方式,动态的组蛋白甲基化和乙酰化修饰在染色体组装、基因转录和DNA
修复等多种生物学进程中起关键作用。其中分别由组蛋白甲基转移酶Setdb1和Ezh2介
导的H3K9和H3K27三甲基化修饰与转录沉默相关,而由COMPASS样蛋白介导的
H3K4三甲基化修饰与转录激活相关。一系列研究表明,组蛋白甲基化修饰通过调节成
骨细胞分化关键转录因子Runx2和Sp7基因的表达影响成骨分化。作为H3K9甲基化的
调节剂,Setdb1与成骨细胞增殖和分化有关。Setdb1的活性和核定位由其结合伴侣Atf7ip
调节。然而,Atf7ip是否参与成骨细胞分化的调节仍然不清楚。
目的:探讨Atf7ip在成骨分化过程中的作用,并进一步揭示其调控机制,为改善骨
形成机制研究提供新的证据和线索。
方法:体外细胞实验:(1)用成骨分化培养基(50g/mL维生素C和10mM的β-
磷酸甘油)处理BMSC细胞0、3、14天,通过qRT-RCR实验,观察Atf7ip的表达;用
成骨分化培养基处理C3H10t1/2细胞0、3、6、12、24、48小时,通过qRT-PCR、Western
blot等实验进一步观察Atf7ip的表达;用骨形成促进剂500ng/mLPTH处理MC3T3-E1
细胞0、12、24、48小时,进一步验证Atf7ip的表达。(2)构建Atf7ip的干扰和过表达
模型,qRT-PCR、Westernblot、碱性磷酸酶染色和茜素红染色等实验观察干扰Atf7ip后
对成骨分化的影响。动物实验:使用osteocalcin-Cre工具鼠针对骨形成成骨分化成熟阶
段构建了条件性敲除小鼠模型,通过micro-CT、VonKossa染色、钙黄绿素双标法和RNA
测序等实验研究Atf7ip对体内骨形成的影响。机制探索:Atf7ip干扰和过表达后,首先
免疫荧光检测Atf7ip对Setdb1细胞内定位的影响。进一步通过qRT-PCR和Westernblot
检测成骨关键转录因子Sp7和Runx2的表达情况。确定可能的调控因子后,Sp7和Atf7ip
的siRNA共同处理MC3T3-E1细胞,通过Westernblot、碱性磷酸酶染色和茜素红染色
等实验探讨Atf7ip影响成骨分化的调控机制。
结果:体外细胞实验:(1)在成骨培养基诱导原代骨间充质干细胞成骨分化过程中,
Atf7ip的表达升高,成骨分化标志物Alp、Runx2、Osteocalcin和Col1a1的mRNA都升
高,进一步使用成骨培养基诱导C3H10t1/2细胞和MC3T3-E1细胞,发现Atf7ip的表达
升高。(2)使用Atf7ip-siRNA处理MC3T3-E1细胞,成骨分化受到促进,成骨分化标志
物Alp、Osteocalcin和Col1a1的mRNA表达升高,碱性磷酸酶染色和茜素红染色阳性
I
细胞明显增多,碱性磷酸酶活力升高。与之相反,使用Atf7ip过表达载体处理MC3T3-
E1细胞,发现成骨分化受到抑制,成骨分化标志物Alp、Osteocalcin和Col1a1的mRNA
表达降低,碱性磷酸酶染色和茜素红染色阳性细胞明显减少,碱性磷酸酶活力降低。动
物实验:采用成骨细胞条件性敲除Atf7ip小鼠实验模型发现,敲除成骨细胞Atf7ip后的
小鼠表现出骨形成增加和骨小梁微结构显着增加。机制上:本文首先研究了Atf7ip
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