实验一血清蛋白质测定.pptx

实验一血清蛋白质测定穿好工作服不得迟到早退保持安静预习听从教师指导认真完成实验报告加强安全观念爱护公共财物money洗净一切仪器用品,桌面整洁干净净仪器洗涤要求试管、烧杯量筒、吸管1实验课结束后,请大家把凳子摆放整齐。2桌面,边台,水池,窗台,仪器要一尘不染,请值日生用抹布擦干净。3值日生最后扫地和拖地,关闭水电门窗,带教老师检查合格后方可离开教室。4实验报告下次实验课前交给老师。实验一血清蛋白质测定一、血清总蛋白质测定(双缩脲法)二、血清白蛋白测定(溴甲酚绿法)三、A/G比值计算方法学介绍蛋白质测定方法很多,常用得有:化学法物理法染料结合法等一、化学法１、凯氏定氮法:用于测定生物物质中总氮含量得方法,其准确度高、精密度好,成为测定蛋白质得最经典得标准方法,但由于其测定手续繁琐,操作复杂,费时,除用作血清蛋白质标准品定值及参考性测定工作外,现已很少在血清总蛋白测定中使用,不适合血清TP得常规测定。一、化学法２、酚试剂法:灵敏度较高,可用于测定脑脊液和尿液中得微量蛋白质,但由于该法就是先测定出酪氨酸得量,再根据酪氨酸在蛋白质中含量而得出蛋白质得含量,因而准确度较差。大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静一、化学法３、双缩脲法:测定蛋白质最古老得方法之一,此反应得优点就是对白、球蛋白产生得颜色反应相近,干扰物质小,且不受温度影响,唯一得缺点就是灵敏度较低,比酚试剂法低约100倍。但本法得检出限为0、2～1、7g/L,这相当于70g/L得血清3～24μl,已能满足临床生化检验得需要,成为临床实验室血清TP首选得最方便,实用得常规方法。二物理法:又可分为紫外吸收法、折射法和重量法等。除紫外吸收法外,其她方法现已很少使用或被淘汰。三蛋白质与染料结合得方法就是比较灵敏而特异得一类方法。用得较多得染料有丽春红、考马斯亮蓝G250和邻苯三酚红钼。丽春红蛋白结合法测得得结果与凯氏定氮法相符,并且显色后在室温可稳定24小时;考马斯亮蓝G250结合蛋白法灵敏度高,特异性强,操作简便,广泛用于尿蛋白,脑脊液蛋白及各种微量蛋白得检测,但该方法测定蛋白浓度得线性范围不宽,与白、球蛋白反应得灵敏度不同,反应强度亦受温度得影响,且比色杯吸附色素而干扰测定,不能用于自动化分析仪,因此该法得应用受到了一定得限制;邻苯三酚红钼络合显色法克服了考马斯亮蓝G250结合蛋白法得上述缺点,且具有简便、稳定等优点,可用于自动化分析仪。双缩脲法测定血清总蛋白【目得与要求】1、掌握双缩脲法测定血清总蛋白得原理和方法;2、掌握分光光度计得使用方法和日常维护;3、熟悉血清总蛋白各种测定方法得原理和优缺点。双缩脲法测定血清总蛋白【原理】血清(浆)中蛋白质得肽键(-CO-NH-)在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定得紫红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合后生成得双缩脲(H2N-OC-NH-CO-NH2)在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色得反应相似,故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰,吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系,经与同样处理得蛋白质标准液比较,即可求得蛋白质含量。【试剂与器材】1、6mol/LNaOH溶液2、双缩脲试剂3、双缩脲空白试剂4、60～70g/L蛋白质标准液5、仪器分光光度计。【试剂与器材】大试管4支1ml吸管３支5ml吸管2支洗耳球１只操作步骤1、取试管4支,标明测定管(U)、标准管(S)、标本空白管(B)、试剂空白管(RB)。操作步骤2、按下表操作。加入物(ml)空白管标准管样本管血清—0、05蛋白标准液—0、05—蒸馏水0、05——TP试剂3、03、03、0—混匀,37度孵育20分钟,540nm比色,空白管调零操作步骤3、混匀,置25℃30min或37℃10min,4、在波长540nm处比色,用蒸馏水调零,测各管吸光度。5、手工操作参数:波长540nm,光径1cm;温度:室温(18-26℃);模式:终点法;反应时间:30min,样本量:100ul,试剂量:5ml、5、计算血清总蛋白(g/L)=样本管吸光度xC标准(g/L)-----------------标准管吸光度血清总蛋白参考范围正常成人血清总蛋白参考范围60～80g/L。长久卧床者约低3--5g/L,60岁以上约低2g/L,新生儿TP浓度较低,随后逐月缓慢上升,大约1岁后达成人水平。【注意事项】1、测定得血清以新鲜为宜,但在冰箱保存而不混浊得标本也可应用,高脂血症混浊血清会干扰比色,可采用下述方法消除:取2支带塞试管或离心管,各加待测血清0、1ml,再加蒸馏水0、5ml和丙酮10ml,塞紧并颠倒混匀10次后离心,倾去上清液,将试管倒立于滤纸上吸去