代谢工程改造大肠杆菌生产己二酸.pdf

摘要

摘要

己二酸是合成尼龙6,6的关键前体。利用微生物生产己二酸的方法相较于化学合成

法具有环境友好、条件温和的优势，然而，目前微生物法合成己二酸的生产工艺存在路

径瓶颈多、合成前体不平衡的问题，降低了己二酸的生产效率。本研究选择一株高产琥

珀酸的大肠杆菌作为底盘菌株，通过解除路径限速步骤、菌株重测序比较、平衡前体供

给、发酵条件优化等策略，有效提高了己二酸的产量与得率。主要研究结果如下：

(1)己二酸生产菌株的构建：首先，本研究基于文献重新构建了一条以葡萄糖为底

物，乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A为前体，5种路径酶参与的己二酸合成途径。其次，以

胞内己二酸合成前体浓度为筛选指标，从E.coliDH5α、E.coliJM109(DE3)、E.coliBL21

(DE3)、E.coliMG1655、E.coliFMMEN-2和E.coliW3110菌株中确定E.coliFMMEN-2

为最佳底盘菌株。最后，以重组质粒pTrcHisA-0875-2399-0067和pTet-1647-2576-7为载

体构建己二酸合成路径，并将路径引入到底盘菌株中，获得菌株E.coliJL00。经72h

的摇瓶发酵，菌株E.coliJL00的己二酸产量为0.34g·L-1，得率为0.08g·g-1。

(2)己二酸生产菌株的比较基因组分析：首先，将E.coliFMMEN-2菌株与对照菌

株E.coliBL21(DE3)菌株进行比较基因组重测序分析发现：差异基因主要分布在葡萄糖

转运系统、中心代谢途径、氨基酸代谢途径和转录调控代谢途径，其中40%的差异基因

集中在中心代谢途径。其次，在与中心代谢途径有关的差异基因中，E.coliFMMEN-2

菌株的acs、pank和btsT等基因的转录水平均高于对照菌株，其中acs和pank基因与前

体乙酰辅酶A的合成密切相关。最后，E.coliFMMEN-2菌株中乙酰辅酶A合成酶和

泛酸激酶的酶活力均高于E.coliBL21(DE3)菌株。因此，可通过强化acs和pank基因

的表达以增加前体的供应，从而提高己二酸的产量。

(3)己二酸合成路径的优化：首先，通过体外实验对合成路径中的关键限速酶进行

鉴定，确定了Tfu_1647是路径中的关键限速酶。其次，利用高强度的RBS03调节限速

酶Tfu_1647的表达量，构建了菌株E.coliJL01，己二酸产量为0.87g·L-1，得率为0.12

g·g-1，较对照菌株E.coliJL00分别提高2.6倍和1.5倍。最后，通过过表达乙酰辅酶A

合成酶acs基因、将lpd基因第354位谷氨酸突变为赖氨酸以及敲除编码琥珀酰辅酶A

的β亚基sucD基因相组合的策略，平衡己二酸的前体供应，获得E.coliJL12菌株。在

摇瓶水平上，E.coliJL12菌株己二酸产量达到1.51g·L-1，得率为0.25g·g-1。

(4)己二酸生产菌株的发酵优化与测试：首先，对摇瓶发酵体系中的诱导温度和诱

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导时间进行优化，确定最佳发酵条件为：诱导温度37℃和诱导剂浓度3.0mmol·L，己

二酸产量达1.69g·L-1，得率为0.15g·g-1；其次，在2.4-L发酵罐中对发酵工艺(接种量、

残糖浓度、转速、通气量以及溶解氧)进行优化，在接种量为10%、残糖浓度为2.5-5g·L-1、

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转速为600r·min、通气量为0.5vvm且不控制溶解氧时，己二酸产量最高为22.31g·L，

得率为0.21g·g-1。最后，将发酵体系放大至5-L发酵罐，己二酸的产量达到25.50g·L-1，