Thermomyces_l...检测方法开发与分子改造研究.pdf

摘要

摘要

脂肪酶(lipase,E.C.)是目前应用最广泛的酶之一，可以催化酯化、水解等反

应。具有sn-1,3区域选择性的脂肪酶可以特异性的在甘油骨架sn-1、sn-3位上催化反

应，可以用于甘油二酯(diacylglycerol,DAG)的高效生产。但目前对1,2-DAG、1,3-

DAG的检测和分离方法研究较少，工业使用的sn-1,3选择性脂肪酶的稳定性、特异性

仍有不足。本论文选择具有较高热稳定性的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces

lanuginosuslipase,TLL)为研究对象，尝试开发了区域选择性的检测方法，并基于半理

性设计对野生型TLL进行分子改造以提高其sn-1,3区域选择性。研究结果如下:

(1)TLL的异源表达与优化。通过比较大肠杆菌与毕赤酵母表达系统，选择酶活与

分泌效果更好的巴斯德毕赤酵母作为TLL的异源表达宿主。对比了SCW1、UTH-1、

PAS_chr_0030、MFα-factor四种信号肽对TLL的分泌效果，发现SCW1、UTH-1和

MFα-factor能够实现对TLL的明显分泌，而MFα-fator是最优的TLL分泌信号肽。为

提高TLL的发酵酶活，在摇瓶水平优化了巴斯德毕赤酵母的诱导培养条件，在甲醇诱

导浓度1%、接种量12.5%、培养4d时分泌酶活最高，可达213U·mL-1。

(2)脂肪酶区域选择性检测方法的构建与优化。基于定性的薄层色谱法(thinlayer

chromatography,TLC)，比较不同展开剂对DAG异构体的分离效果。以正己烷:乙醚:乙

酸(50:30:2)为展开剂，樱草灵作为染色剂，以ImageJ软件分析层析板的荧光灰度面

积，分析DAG灰度面积比与浓度比之间的相关性，其R2大于0.97，构建了DAG异构

体的TLC半定量分析方法。建立了超高效合相色谱(ultraperformanceconvergence

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chromatography,UPC)与蒸发光散射检测器(evaporativelightscatteringdetector,ELSD)

联用的DAG定量分析方法，并优化了相关参数，最终可以在13min内分离并定量检

测1,2-DAG(0.025–0.2g·L-1)和1,3-DAG(0.025–0.15g·L-1)。

(3)脂肪酶sn-1,3区域选择性的改造。通过甘油三酯(triacylglycerol,TAG)与TLL

的分子对接，选取底物口袋附件的G82、S83、I86、I90、N92、L93、F95、I202、

2

V203、L206作为突变位点，构建了饱和突变文库。利用建立的半定量TLC法和UPC-

ELSD法对突变文库进行筛选分析，其中最优突变体I202V的re值为76%，较WT-

TLL提高了11.7%。RMSD分子动力学模拟发现突变体结构刚性有所提高，这解释了

I202V热稳定少许提高的原因。而RMSF分析发现Gly82-Ile100区域柔性的提高可能促

进了sn-1,3区域选择性。在I202V中，其活性位点Ser-146亲核进攻sn-3位羰基碳所需

距离缩短了62.5%，这可能是I202V表现出更高sn-1,3区域选择性的原因。此外，本研

究推测I202V中Loop202-204的构象改变影响了TAG的结合方式，其构象变化可能与

TLL区域选择性存在潜在联系。

关键词：脂肪酶；甘油二酯；半理性设计；超临界流体色谱；位置异构体

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