C25羟基化维生素D_3关键酶的挖掘及功能表征.pdf

摘要

摘要

微生物转化法是生产高附加值化合物的一种重要方法，通过构建化学-酶法途径修

饰母核是热门的绿色制药手段之一。25-羟基维生素D（25(OH)VD）作为人体中维生

33

素D3的主要活性形式，可促进人体的钙磷吸收，控制多种细胞反应，具有极高的药用

价值。25(OH)VD3作为临床上应用广泛的原料药，其工业生产受限于复杂的化学合成过

程和高昂的成本，从而限制其在医药领域的广泛应用。微生物转化维生素D3合成

25(OH)VD3是一项绿色高效的创新技术，具有替代传统化学合成法的潜力。为了获取具

有羟基化维生素D3功能的微生物，从自然界中筛选新微生物或构建基因工程菌均是有

效的手段。本论文采用唯一碳源平板法从自然界分离具有羟化维生素D3生成目标产物

25(OH)VD3能力的菌株，并对其进行发酵工艺优化提高转化效率。进一步通过转录组学

技术挖掘获得目标菌株中的C25羟基化维生素D3的关键酶基因。在此基础上，通过构

建异源表达C25位羟基化维生素D3关键酶的工程菌株，以验证关键酶的催化功能。主

要研究结果如下：

（1）C25位维生素D3羟基化菌株的筛选及发酵工艺优化。通过唯一碳源平板法，

从林地土壤中分离获得一株具有羟基化维生素D3能力的菌株1-18，可生成目标产物

25(OH)VD和副产物1,25-羟基维生素D（1α,25(OH)VD）。经16SrDNA测序鉴定，

3323

目标菌株为巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium），命名为B.megateriumH-1。通过单因

素法优化发酵工艺，确定B.megateriumH-1的最佳发酵条件为：初始pH值7.5，甘油助

溶底物浓度6%（V/V），发酵6h时投入底物维生素D，接种量2%（V/V）。优化后目标

3

产物25(OH)VD3的浓度在发酵36h时达到1.43mg/L。

（2）C25羟基化维生素D关键酶的挖掘及生物信息学分析。采用转录组测序技术，

3

对经维生素D3诱导12h前后的B.megateriumH-1进行测序分析，共获得4270个转录本

信息。进一步对含有细胞色素P450结构域（PF00067）的转录本进行筛选，发现5个细

胞色素P450酶（CYPs）基因。结合NCBI数据库比对结果发现其中4个CYPs分别属

于CYP102、CYP106和CYP109家族。其中，来自CYP109家族的CYP-1、CYP-2分别

对应已知维生素D3的C25位羟基化酶CYP109E1和CYP109A2，故将CYP-1和CYP-2

分别命名为CYP109E1-H和CYP109A2-H。通过克隆测序获得其基因序列cyp109e1-h和

cyp109a2-h，经生物信息学分析发现CYP109E1-H和CYP109A2-H分别为CYP109E1和

CYP109A2的自然突变体，因此推测CYP109E1-H和CYP109A2-H可能是B.megaterium

H-1中C25位羟基化维生素D3的关键酶。

（3）C25羟基化维生素D3关键酶的异源表达与功能验证。基于上述结果，成功实

现CYP109E1-H和CYP109A2-H在枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）WB600体系中的异

源表达，并获得重组基因工程菌WB600-pMA5-CYP109E1-H和WB600-pMA5-

I