L-天冬氨酸α-脱羧酶的挖掘、改造及在催化合成β-丙氨酸中的应用.pdf

摘要

摘要

L-天冬氨酸α-脱羧酶（PanD）能够特异性催化L-天冬氨酸脱羧生产β-丙氨酸，是

生物合成β-丙氨酸、泛酸、肌肽等化合物的关键酶。其中，β-丙氨酸是多种医药合成的

重要砌块，在食品、饲料、化妆品等领域也有着广泛的应用，是12种最具潜力的三碳

化合物之一。酶法合成β-丙氨酸因其更加绿色、高效、可持续，是目前β-丙氨酸合成的

主流方法。目前普遍使用的是谷氨酸棒杆菌和枯草芽孢杆菌来源的L-天冬氨酸α-脱羧

酶，但这两种来源的酶合成β-丙氨酸或其下游产物的瓶颈是较低的酶活。为解决这一问

题，本研究对L-天冬氨酸α-脱羧酶进行基因挖掘与分子改造，并通过半理性设计提升新

酶的催化性能，建立全细胞催化合成β-丙氨酸的工艺，具体研究结果如下：

（1）挖掘出新的L-天冬氨酸α-脱羧酶，其酶学性质优于现使用的酶。结合已有的

L-天冬氨酸α-脱羧酶序列信息，选择能够形成丙酮酰基的枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌

来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶为探针，基于Uniprot蛋白数据库进行BLAST分析，确定

了6种不同来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶基因，分别进行了全细胞催化活性、纯酶活性

比较及酶学性质测定。挖掘出来源于杰氏棒状杆菌的L-天冬氨酸α-脱羧酶，野生酶催化

活性高于正在使用的其他来源的酶。其酶活为9.8U·mg-1，是6种L-天冬氨酸α-脱羧酶

-1

中活性最高的，对底物的亲和力也是最好的，KM值为3.6±0.8mmol·L。对活性最高的

杰氏棒杆菌来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶进行分子改造，进一步提高了其催化效率。

（2）通过基于结构的半理性设计，成功对杰氏棒杆菌来源的L-天冬氨酸α-脱羧酶

进行了功能进化，提升了酶活力和稳定性。利用AlphaFold2预测了杰氏棒杆菌来源的L-

天冬氨酸α-脱羧酶的蛋白结构并与底物进行了分子对接。通过序列保守性分析和Rosetta

中的结合自由能模块对结合口袋5Å范围内的氨基酸残基进行虚拟突变，选择突变后解

折叠自由能（ΔΔG）降低的非保守位点进行CAST饱和突变。通过全细胞催化体系初步

筛选以及酶纯化后的复筛，获得了4个活性提升的突变体，分别为R3K、C26V、I88M、

Y90F。对4个突变体的位点进行组合后，形成的组合突变体I88M-Y90F-C26V-R3K酶

活为25.5U·mg-1，较野生型的9.8U·mg-1提高了2.6倍。动力学分析结果表明，突变体

-1-1

KM值为2.3mmol·L，较野生型的3.6mmol·L降低，表明突变体对底物的亲和力更强。

突变体的Tm值为82℃，其稳定性较野生型有所提高。

（3）利用分子动力学模拟（MD）对突变前后的三维结构变化进行了解析。结果显

示,突变体整体的均方根偏差（RMSD）值较野生型略微下降，突变体相较于野生型具有

更高的稳定性。通过分析酶分子突变前后底物口袋的构象发现，88位异亮氨酸突变为甲

硫氨酸，末端甲基的取向发生改变，由朝向Lys9变为朝向外侧；90位酪氨酸突变为苯

丙氨酸后，苯环对位上没有了羟基取代，Gly24、Lys9距离底物L-天冬氨酸的相对位置

更加接近，Lys9的氨基与底物L-天冬氨酸的α羧基距离由2.8Å缩短至2.2Å，其与L-

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天冬氨酸α羧基的结合更加紧密，有利于催化脱羧反应的进行；26位突变为缬氨酸后有

利于酶的正确折叠；3号位点与活性中心有着较强的动态耦合，3号位点发生扰动时会

传递给活性中心。

（4）初步建立了突变体在大肠杆菌中的高密度发酵和全细胞催化工艺。在5L发

酵罐中对I88M-Y90F-C26V-R3K突变体进行发酵实验，当菌体密度达到OD600=60后间

隔两小时添加诱导剂IPTG，IPTG终浓度为0.6mmol·L-1，发酵26h左右菌体量达到

OD600=120，最高酶活为2853.87U·mL-1。以OD600