氨基酸脱氢酶分子改造及其多酶体系合成D.pdf

摘要

D-丝氨酸（D-Ser）起到调节人类神经系统的功能，在医药领域，可以作为治疗由感

染引起的肺结核病的药物中间体，可以用于治疗可卡因依赖症、精神分裂症。在化妆品

领域，D-Ser可以作为活性物质添加到护肤品中。目前，合成D-Ser的主要方法普遍存在

着污染环境、产率低等缺点。前期研究已经构建出了一条耦联来源于Proteusmirabilis的

L-氨基酸脱氨酶（PmirLAAD）、来源于Symbiobacteriumthermophilum的D-氨基酸脱氢酶

StDAPDHBurkholderiastabilisBsFDH

（）和来源于的甲酸脱氢酶（）的多酶级联路线，

能够以廉价易得的L-氨基酸为底物，最终合成D-氨基酸。然而，上述酶及其多酶体系合

成D-Ser的产率和光学纯度仍然有限。为了开发可用于高选择性合成D-Ser的氨基酸脱氢

酶，并构建一条能够高效合成D-Ser的多酶级联体系，本研究开展了关键酶的分子改造

和多酶体系构建优化研究，具体结果如下：

（1）通过D-Ser合成关键功能酶的催化活性表征，确定了该多酶级联路线各模块所

需要的模块酶，并对各模块的催化特性进行了考察，其中PmirLAAD的最适温度为

42°C，在温度>50°C时活性明显下降。当pH>7时，PmirLAAD的催化活性一直处于较高

状态，但是当pH<7时，活性则明显下降，因此PmirLAAD适合在碱性条件下进行催

pHStDAPDH/H227VpH9.535-50°C

化，且受到的影响较小。的最适为，催化活性在之

间受到温度的影响较小，相对酶活较高。PmirLAAD和StDAPDH/H227V催化的反应均

BsFDHpH7.0-10.5pH

无逆反应发生。在的碱性环境下催化活性随着的升高稍有下降，

但变化不明显，一直处于较高的催化活性。在25-50°C内，BsFDH的催化活性随着温度

的上升而上升。经过考察，发现各模块酶的反应条件可以兼容。

（2）通过分子改造提高了StDAPDH/H227V对中间体羟基丙酮酸的催化活性，从而

提升了整个多酶级联路线的催化效率。利用分子对接预测了口袋中与底物结合的四个关

92D122D152M253N4

键残基、、和，通过单点饱和突变获得株活性明显提高的突变体

D92E、D122W、M152S和N253Y，再进行迭代突变，最终获得一株

D92E/D122W/M152S突变株，比活提高了8.11倍。利用分子动力学推测酶活性提高的原

因可能与活性口袋大小的变化以及底物与关键残基之间分子相互作用的增强有关。

（3）将氧化脱氨模块（PmirLAAD）、还原胺化模块（StDAPDH/H227V/D92E/

D122W/M152S）和辅酶循环模块（BsFDH）进行组装，构建成多酶级联体系，考察其催

化性能，以及对其他氨基酸的催化效率。为了能使该多酶级联路线生成D-Ser的产率达

到最大，本研究从pH、温度、酶添加比例等方面进行了调节优化，发现该路线在50mM

+

Tris-HCl缓冲液（pH9.5）、甲酸钠浓度为100mM、NADP浓度为2.5mM、NHCl浓度

4

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为100mM、PmirLAAD全细胞50mg·mL、StDAPDH/H227V/D92E/D122W/M152S纯酶

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