蛋白质工程改造丙酮酸脱羧酶提升酪醇产量的研究.pdf

摘要

摘要

酪醇(Tyrosol)作为具有药理活性的芳香醇类化合物，被广泛应用于医药和化工领域。

酪醇可由本实验室之前构建的四酶级联路径进行全细胞转化合成，但路径中来源于

Candidatropicalis的丙酮酸脱羧酶(CtPDC)活性低，催化中间产物对羟基苯丙酮酸(4-

hydroxyphenylpyruvicacid，4-HPP)的脱羧效率低，是合成酪醇级联路径中的限速酶。

本研究首次解析了CtPDC的晶体结构，并对其催化机制进行了分析。以结构和机制为

基础，对变构酶CtPDC进行蛋白质工程改造，获得的最优突变体提升了酶活和脱羧转

(moleculardynamicsMD)

化率；后续通过分子动力学，模拟等手段解析了突变体性能提

升的机制。将CtPDC最优突变体应用于酪醇的生产，通过后续的条件优化进一步提升

3L

了酪醇的产量，并实现了发酵罐内放大体系的酪醇制备。主要的研究结果如下：

(1)确定合成酪醇级联路径中的限速酶。首先，在不同底物浓度下进行L-酪氨酸的

全细胞转化实验，测定反应液中各物质的量，发现随着底物浓度的升高，CtPDC催化

的底物4-HPP出现逐渐积累的现象；随后进行了纯酶的体外转化实验，在体外仅增加

CtPDC4-HPP4

的量发现的积累现象缓解，加之对个纯酶的动力学参数测定，发现

CtPDC的催化效率最低。以上结果确定了限速酶为CtPDC。

(2)CtPDC的蛋白质结晶和结构机制解析。首先，对重组菌株E.coli-pET28a-CtPDC

进行分离纯化。先利用商业化晶体筛选试剂盒进行结晶条件的初筛，确定结晶条件后

进行复筛优化，在最优条件下获得分辨率分别为3.05Å的空蛋白晶体(PDB编号为8HP2)

与2.52Å的蛋白-辅因子复合物晶体(PDB编号为8HP4)；随后对得到的晶体结构进行亚

基聚合方式及二级结构的分析，并通过分子对接后的突变验证，确定了催化区和变构

区的关键残基；最后推测了CtPDC的底物变构激活机制及脱羧机制。

(3)蛋白质工程改造提升CtPDC脱羧活性。为了促进催化区的脱羧效率，基于底物

结合在变构区引起的变构调节进行蛋白质工程改造，最后获得最优突变体Mu的酶活相

5

WT10.1120.9%MD

较于野生型提升了倍，脱羧转化率提升了；随后通过模拟和结合自

由能计算结果发现：Mu模型中的底物结合更加稳定，涉及到催化区ylide中心形成(C2

5

去质子化的两个关键距离)(D(O-G415/S415)-H4和DC2H-N4)都有所缩短，随后发现亲核进攻距

离从3.8Å缩短为3.0Å，进一步从代表性快照的对比发现整个变构传输通路从20.4Å缩

短至18.6Å，变构传输通路两侧的Loop环也变得更加灵活。

Mu5Mu5

(4)CtPDC在酪醇合成中的应用。将原本路径中的CtPDC以CtPDC替换，虽然

路径中4-HPP的积累减少，但效果并不显著。随后通过SDS分析发现蛋白表达失

衡，所以通过双质粒载体组合优化调整了四个酶的表达水平。而后进行了转化条件的

优化，相比于之前的研究，缩短了反应时间并降低了辅因子ThDP的添加量；最后，在

-1

3L发酵罐中放大，在反应24h后，酪醇产量为38.0g·L，转化率达到99.6%，时空产率

-1-1

为1.6g·L·h。

关键词：酪醇；丙酮酸脱羧酶；蛋白质工程；分子动力学模拟