肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶的表达、分子改造及应用于合成α-熊果苷的研究.pdf

摘要

摘要

α-熊果苷(α-arbutin)是一种对苯二酚(Hydroquinone)的糖基化衍生物。α-熊果苷因其

作用机制广泛，常用于化妆品行业及临床药物治疗。酶法和全细胞转化法是α-熊果苷的

主要生产方法，而低催化效率的酶限制了α-熊果苷的生产。本研究以Leuconostoc

mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶(Sucrosephosphorylase,SPase)为出发点，结合半理性

酶改造与α-熊果苷的合成工艺优化，实现了α-熊果苷的5L发酵罐高效生产。主要研究

结果如下：

(1)将基因gtfA分别导入至大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌中。优化各宿主

菌株的全细胞转化菌体量，在转化24h后，B.subtilis168/pMA5-gtfA的α-熊果苷产量高

达80.9g·L-1，摩尔转化率为81.6%，是E.coliBL21/pET28a-gtfA产量(27.9g·L-1)的2.9

倍。

(2)测定野生型蔗糖磷酸化酶的酶学性质，其比酶活为48.6U·mg-1。针对酶活力不高

的问题，利用计算机模拟半理性设计突变点，以筛选酶活力较高的突变体。首先通过分

子对接结果得到潜在的有益突变点R137、F160和L337位点。对这三个位点建立饱和

突变文库，筛选得到一株酶活性为野生型161%的突变体R137F。

(3)对突变体酶R137F和野生型酶进行分子动力学模拟和动力学参数测定。R137F对

底物对苯二酚的Km比野生型降低了近2.4倍，kcat/Km比野生型提高了4.6倍；同时，

R137F的RMSF高于野生型，表明R137F突变体蛋白结合口袋的灵活性增加，这解释

了突变体酶催化效率提高的原因。

(4)经验证，重组菌株B.subtilis168/pMA5-gtfAR137F的α-熊果苷产量为原始菌

株B.subtilis168/pMA5-gtfA的1.2倍。优化重组菌株B.subtilis168/pMA5-gtfAR137F的

全细胞转化条件，其最适反应条件如下：pH7.0，温度30℃，菌体浓度OD600为50；初

始对苯二酚浓度为45g·L-1，对苯二酚采用分批投料方式添加。转化条件优化后的α-熊

果苷产量为107.9g·L-1，摩尔转化率为87.3%。

(5)在最适全细胞转化条件下，将重组菌株B.subtilis168/pMA5-gtfAR137F置于5

L发酵罐中转化24h，最终α-熊果苷的产量为119.3g·L-1，摩尔转化率为96.5%，相比

原始菌株B.subtilis168/pMA5-gtfA的产量提升了47.5%。

关键词：α-熊果苷；蔗糖磷酸化酶；枯草芽孢杆菌；定向进化

Abstract

Abstract

α-arbutinisaglycosylatedderivativeofhydroquinone.α-arbutiniscommonlyusedinthe

cosmeticindustryandclinicaldrugtherapybecauseofitsbroadmechanism.Enzymaticmethod

andwhole-cellbiotransformationarethemainproductionmethodsofα-arbutin,whileenzymes

withlowcatalyticefficiencylimittheproductionofα-arbutin.Inthisstudy,thesucrose

phosphorylase(SPase)fromLeuconostocmesenteroideswasusedfortheefficientproduction

ofα-arbutinin5Lfermenter