β-甘露聚糖酶热稳定性改造及其高效表达.pdf

摘要

摘要

β-甘露聚糖酶（EC8）能够切割甘露聚糖中的β-1,4糖苷键并产生聚合度为

2-10的低聚甘露糖，目前已被应用到食品、石油开采、造纸、医疗、饲料添加等多个

行业中，并且其水解产生的低聚甘露糖属于膳食纤维，对人体健康也有巨大作用。但

是β-甘露聚糖酶的工业应用条件较为严格，比如饲料制粒、石油破胶、咖啡提取等领

域往往需要较强的耐热性和较高的酶活力才能发挥价值，同时我国目前主要的商用β-

甘露聚糖酶的耐高温表现还不够良好，因此获得一株耐热性更强的β-甘露聚糖酶菌株

越来越受到研究者的重视和关注。本课题以来自黑曲霉的甘露聚糖酶基因Anman为研

究对象，对其进行异源表达、热稳定性改造和发酵优化，主要研究内容如下：

（1）Anman基因在PichiapastorisX33中的高效表达。构建了重组质粒pPICZ-

Anman并转入宿主菌株P.pastorisX33，获得重组工程菌株P.pastorisX33-Anman。上

述重组菌株在摇瓶中诱导72h后测定其酶学性质，筛选得到的优秀菌株酶活力为159.8

U∙mL−1，蛋白浓度为0.17mg∙mL−1，蛋白分子量约为47kDa，最适温度和pH分别为

72.5℃和3.0，并在60℃以下和pH3.0-7.0内保持稳定。

（2）重组菌株高密度发酵。将重组菌株P.pastorisX33-Anman在5L发酵罐中高

密度发酵，诱导108h后的上清液酶活力达到最高，为1166U∙mL−1，蛋白浓度为1.27

mg∙mL−1，分别是摇瓶发酵水平的7.3倍和7.5倍。测定上清液喷雾干燥得到的甘露聚

糖酶酶粉发现，其最高酶活力是商用甘露聚糖酶的10.6倍，并且热稳定性和pH稳定

性几乎一致。

（3）柔性改造野生型甘露聚糖酶热稳定性。通过温度因子和吉布斯去折叠自由能

变，从Anman中筛选到了多个柔性位点，再结合β-转角的氨基酸偏好性设计了6个柔

性改造单点突变体。经表征发现其中5个突变体热稳定提高且酶活力无明显降低，将5

个单点突变组合得到Mut5，其热稳定性从46.2%提升至82.4%，并且半衰期提高至8.8

倍，Tm值提高2℃，并且突变并未影响Mut5的动力学性质。通过分子动力学模拟和限

制性网络分析发现了Mut5相比Anman在整体构象和局部构象均稳定性增强，并且从

分子水平上揭露了新增的氢键、盐桥和疏水相互作用是Mut5热稳定性增强的原因。

（4）发酵优化。以P.pastorisX33-Mut5为出发菌株在摇瓶水平上优化了诱导温

度，发现25℃的诱导温度比28℃提高0.3倍酶活力。再在发酵罐水平上优化了诱导碳

源，发现双碳源诱导的上清液酶活力达到2465U∙mL−1，分别是摇瓶发酵和单碳源高密

度发酵的14.8倍和2.1倍。

关键词：甘露聚糖酶；毕赤酵母；热稳定性；柔性改造

Abstract

Abstract

β-mannanase(EC8)cancuttheβ-1,4glycosidicbondinmannanandproduce2-

10oligomanosaccharide,whichhasbeenappliedinfood,oilexploitation,pulp,medical

treatment,feedadditionandotherindustries.Itcannotonlycreateindustrialbenefits,andthe

mannose-oligosaccharideproducedisdietaryfiber,whichisalsogreatforhumanhealth.

However,theindustrial