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2024-01-28

实验十五表达载体的构建

目

录

引言

实验材料

实验方法

实验结果与分析

实验注意事项与技巧

实验拓展与应用

引言

01

01

02

掌握基因克隆和表达载体构建的基本实验技能

构建适用于目标基因表达的表达载体

01

02

03

基因表达载体的构建是基因工程中的核心技术之一，它是将目的基因与特定的表达元件组合在一起，形成能够在宿主细胞中稳定遗传并表达目标蛋白的重组DNA分子。

表达载体的构建通常包括选择合适的载体、设计引物、PCR扩增目的基因、酶切和连接等步骤。其中，选择合适的载体是构建表达载体的关键，需要考虑载体的类型、复制子、选择标记、表达元件等因素。

在构建表达载体的过程中，需要注意保持无菌操作，避免外源DNA的污染，同时还需要对构建的表达载体进行验证，以确保其正确性和有效性。

实验材料

02

质粒载体

常用的克隆载体，具有自主复制能力，并带有选择性标记基因，如抗生素抗性基因。

噬菌体载体

用于在细菌中表达外源基因的载体，具有将外源基因整合到细菌染色体上的能力。

病毒载体

用于在真核细胞中表达外源基因的载体，能够将外源基因包装到病毒颗粒中，感染并整合到宿主细胞基因组中。

需要克隆和表达的外源基因，可以是cDNA、基因组DNA或合成DNA片段。

目的基因

用于驱动目的基因在宿主细胞中的转录和表达的DNA序列。

启动子

用于终止转录过程并稳定mRNA的DNA序列。

终止子

琼脂糖凝胶电泳试剂

抗生素

用于选择带有抗生素抗性基因的克隆细胞，如氨苄青霉素、卡那霉素等。

X-gal

5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，用于蓝白斑筛选，区分带有lacZ基因的克隆细胞。

DNA提取试剂

用于从细菌或细胞中提取DNA的试剂，如酚/氯仿、乙醇等。

用于培养细菌的培养基，提供细菌生长所需的营养物质。

LB培养基

IPTG

异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，用于诱导带有lacZ基因的表达载体的表达。

用于DNA片段的分离和检测，包括琼脂糖、TAE缓冲液、EB染料等。

实验方法

03

选择合适的表达载体

根据实验需求，选择具有合适抗性、复制起点、启动子、多克隆位点等元件的表达载体。

载体的扩增与提取

将表达载体转化入大肠杆菌感受态细胞，通过扩增培养，提取高质量的质粒DNA。

目的基因的获取

通过PCR扩增、基因合成或从cDNA文库中调取等方式获得目的基因片段。

目的基因片段的纯化

通过凝胶电泳、PCR产物纯化试剂盒等方法对目的基因片段进行纯化，去除引物、dNTPs等杂质。

将载体DNA与目的基因片段按照一定比例混合，加入连接酶及缓冲液，建立连接反应体系。

根据连接酶的特性及DNA浓度，调整连接反应的温度和时间，以获得最佳的连接效率。

连接反应条件的优化

连接反应体系的建立

实验结果与分析

04

显示连接产物的大小和纯度，验证连接反应是否成功。

连接产物电泳图

产物条带分析

产物浓度测定

对电泳图中的条带进行分析，确认目的基因与载体连接成功。

通过电泳结果估算连接产物的浓度，为后续实验提供参考。

03

02

01

采用抗生素抗性筛选或蓝白斑筛选等方法，筛选阳性转化子。

转化子筛选方法

对筛选出的阳性转化子进行验证，确认其含有目的基因。

阳性转化子验证

统计筛选出的阳性转化子数量，评估转化效率。

转化子数量统计

03

突变分析

分析测序结果中的突变情况，评估对后续实验的影响。

01

测序引物设计

根据载体和目的基因序列设计测序引物。

02

测序结果比对

将测序结果与目的基因序列进行比对，确认插入片段的正确性。

实验结果总结

总结实验结果，包括连接产物电泳、转化子筛选和插入片段测序等方面的结果。

结果讨论与分析

对实验结果进行讨论和分析，解释可能的原因和影响因素。

后续实验建议

根据实验结果提出后续实验的建议和改进措施。

实验注意事项与技巧

05

选择合适的载体

根据实验需求选择合适的载体，如质粒、病毒等。考虑载体的复制子、选择标记、多克隆位点等特性。

插入片段的准备

获取目的基因或片段，通过PCR扩增、酶切等方式获得合适大小的片段，注意片段的纯度和浓度。

根据载体和插入片段的酶切位点选择合适的限制性内切酶，确保酶切效率和特异性。

限制性内切酶的选择

按照厂商推荐的保存条件进行保存，避免反复冻融和长时间暴露于空气中。

工具酶的保存

VS

根据实验需求选择合适的连接酶，如T4DNA连接酶等。注意酶的活性和特异性。

连接反应条件的优化

调整连接反应中载体与插入片段的比例、连接酶用量、反应时间等条件，以提高连接效率。

连接酶的选择

根据实验需求和宿主细胞类型选择合适的转化方法，如化学转化、电转化等。

转化方法的选择

利用载体的选择标记（如抗生素抗性基因）进行筛选，同时可通过PCR、测序等方法验证插入片段的正确性。注意筛