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第1页,课件共9页,创作于2023年2月一、实验目的掌握定量测定蛋白酶活性的方法,了解本实验的酶、底物和生成物的相关性,以及本反应的环境条件。进一步理解酶活力和比活力的概念巩固比色法测定物质含量的基础,掌握分光光度计使用方法,学习绘制标准曲线的方法第2页,课件共9页,创作于2023年2月二、实验原理1.胰蛋白酶是一种水解酶,将酪蛋白水解成酪氨酸等物质。2.所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质。酚试剂又名Folin试剂,是磷钨酸和磷钼酸的混合物,在碱性条件下极不稳定,可被酚类化合物还原产生蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物,680nm)。3.用分光光度计可以定量比较颜色深浅,测定酪氨酸生成量,根据生成物的含量可以计算胰蛋白酶的活力。胰蛋白酶活力越高,生成的酪氨酸越多。4.蛋白酶活力单位定义:在40?C,pH7.5的条件下,反应10min,以每min水解酪蛋白产生1?g酪氨酸为1U。第3页,课件共9页,创作于2023年2月三、器材仪器和主要试剂可见光分光光度计水浴锅Folin–酚试剂0.5%酪蛋白100?g/mlTyr溶液三氯醋酸Na2CO3胰蛋白酶
第4页,课件共9页,创作于2023年2月四、实验操作1、酪氨酸标准曲线的制作管号123456样品、对照滤液(各2支试管)100?g/mlTyr(ml)00.20.40.60.81.0每支管加1ml水(ml)1.00.80.60.40.20稀释后Tyr浓度(μg/ml)020406080100Na2CO3(ml)5555555Folin-酚试剂(ml)1111111迅速混合,于40℃放置15分钟A680nm调0A样、A对照以酪氨酸的浓度(μg/ml)为横坐标,A680nm为纵坐标,作出标准曲线。管号酶液(ml)酪蛋白(ml)三氯醋酸(ml)40℃水浴准确保温10分钟三氯醋酸(ml)酪蛋白(ml)40℃水浴保温10分钟,过滤得滤液样品管12----3-------对照管1----3------2第5页,课件共9页,创作于2023年2月2、蛋白酶活力的测定按下表操作,然后测定滤液中的酪氨酸含量。滤液各取1ml,进行显色反应(加Na2CO35ml+Folin-酚试剂1ml,40?C保温15min)以标准曲线中的1号管调0,测定A样(样品液A680nm值)和A对(对照液A680nm值);管号酶液(ml)酪蛋白(ml)三氯醋酸(ml)40℃水浴准确保温10分钟三氯醋酸(ml)酪蛋白(ml)40℃水浴保温10分钟,过滤得滤液。1′号(样品)12----3-------2′号(对照)1----3------2第6页,课件共9页,创作于2023年2月3.酶活力计算胰酶活力定义:40℃,pH7.5,反应10min,每分钟水解酪蛋白产生酪氨酸1微克为一个酶活力单位。计算:1g蛋白酶所具备的总活力单位为:(A样-A对)×K×V/t×NA样:样品液光吸收值;A对:对照液光吸收值;K:标准曲线上A680nm为1时的酪氨酸微克数;t:酶促反应的时间(min),本实验t=10min;V:酶促反应管的总体积(ml数),本实验V=6;N:本次实验酶液的稀释倍数:6000第7页,课件共9页,创作于2023年2月五、思考题酶的试验为何设对照又要设空白?稀释的酶溶液是否可长期使用?说明原因。计算公式中的v=6该如何理解本实验用什么方法终止酶促反应?还有其他方法可以终止反应吗?如何保证本实验测定数据的准确性?胰蛋白酶的比活力如何计算?第8页,课件共9页,创作于2023年2月感谢大家观看第9页,课件共9页,创作于2023年2月************************
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