细胞工程培养细胞的生长增殖过程.ppt

10.待细胞完全脱离后，加入适量的含血清的培养基终止反应如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃去的胰酶溶液流失。也可以在倒数第二、三步时弃去胰酶，用瓶中残留的胰酶继续作用至最后一步的消化程度，这样略有点过也影响不大。第30页，课件共57页，创作于2023年2月刚加入胰酶，细胞仍呈致密单层：第31页，课件共57页，创作于2023年2月

细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态：

第32页，课件共57页，创作于2023年2月细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下：

第33页，课件共57页，创作于2023年2月检查细胞形态及活力：状态良好的细胞应是轮廓不十分清晰，而生长不良的细胞轮廓反而清晰，细胞间隙增大，有空泡、脂滴、颗粒出现，细胞形态不规则。第34页，课件共57页，创作于2023年2月检查营养液PH及污染：新鲜的呈桃红色，PH在7.2-7.4之间。培养一段时间后，PH下降，培养液变黄。ＣＯ２培养箱可自动控制5%ＣＯ２的含量。第35页，课件共57页，创作于2023年2月细胞计数培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：人工计数第36页，课件共57页，创作于2023年2月第37页，课件共57页，创作于2023年2月程序

用酒精冲洗计数板后擦净，将盖片覆在计算板上，微微移向一侧，以便滴加细胞悬液.取一吸管伸入培养瓶，轻轻吹打细胞悬液，混匀。从盖片边缘滴加细胞悬液，使其充满计数板和盖片间的空隙中。注意：勿使液体漫过盖片或出现气泡。镜下观察计数：计算计数板四角大格内的细胞数，压线者只计算左侧和上方的,右侧和下方的不计算在内。

按下式计算：细胞数/毫升原液=注意：镜下计数，有时偶尔有两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团占10%以上,说明消化不充分；细胞数少于200个/10平方毫米或多于500个/10平方毫米

时，均说明稀释不当，需重新置备细胞悬液,再计算。第38页，课件共57页，创作于2023年2月细胞计数：细胞悬液制备后，要计算所含的细胞数量。一般以细胞数/毫升表示。用品：细胞悬液,培养液,计数板。第39页，课件共57页，创作于2023年2月1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。

2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

3、静置3分钟。

4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：

细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

计数法:

第40页，课件共57页，创作于2023年2月寻根问底胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？提示：胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。第41页，课件共57页，创作于2023年2月第1页，课件共57页，创作于2023年2月一体外培养细胞的生长增殖过程原代培养期:从体内取出组织接种培养到第一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。这个阶段细胞比较活跃，有细胞分裂，但不旺盛。传代期：从原代培养的细胞的一经传代后便称细胞系。细胞增殖旺盛，当传代10-50次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。衰退期：细胞增殖缓慢或不增殖。细胞轮廓增强，最后衰退凋亡。第2页，课件共57页，创作于2023年2月1.原代培养（PrimaryCulture）期：

也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（CloningEfficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。第3页，课件共57页，创作于2023年2月2．传代期

初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持续时间最