第八章现代生物学课件.pptVIP

酵母表面展示技术的应用蛋白质的定向进化：酵母表面展示系统用于蛋白质亲和力和稳定性的定向进化已有成功报道，最先被用于抗体的亲和力成熟。活的口服疫苗：在细胞表面表达的蛋白质易于接近抗体，因此，可被免疫系统识别，即使很小的肽，当展示在细胞表面时，也具有免疫原性。因而可通过在酵母表面表达异质性的抗原蛋白来发展疫苗。第四节其他新蛋白质工程技术目前新兴的蛋白质工程技术原子力显微镜技术蛋白质打靶技术蛋白质分子印迹技术蛋白质截短技术蛋白质错误折叠循环扩增技术一、原子力显微镜技术原子力显微镜（atomicforcemicroscope，AFM）由G.Binnig等于1986年发明，是扫描探针显微镜家族的主要成员，其横向分辨率为2～3nm，纵向分辨率为0.5nm。它可以在接近生理环境的大气或液体条件下成像，获得直观的三维表面信息，还可以对原子和分子进行纳米级操纵，因此在生物结构的研究中具有独特的优势。原子力显微镜系统结构1原理AFM的基本原理是通过控制并检测样品—针尖间的相互作用力来分析研究样品的表面性质的。其工作原理如图所示。2应用采用AFM研究了白蛋白、血红蛋白、胰岛素及分子马达和噬菌调理素等吸附在不同固体界面上的行为。用于蛋白单分子结构与功能研究。AFM可用于观察蛋白质的分子结构及其参与的生理活动等。如抗体结构、纤维蛋白聚合、胶原装配、抗原抗体识别等。对一些生理过程，从形态学角度进行了证实。3目前存在的问题目前，利用AFM研究的蛋白种类还很少，能检测到的蛋白性质的参数数量也是十分有限，亟需进一步扩展AFM在蛋白研究中的应用范围，增强仪器应用的功能性。由于AFM在机械设计上的限制，单分子高分辨拓扑结构的记录时间比大多数生物过程发生的时间相比长得多，提高扫描速度是对扫描器的设计工艺乃至材料科学的发展提出了巨大的挑战现有AFM探针的设计具有明显的物理局限性，由于AFM分辨率和功能与探针性能的密切相关性，因而探针的改造工艺的提高也是亟待解决的关键问题1原理1989年建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统，右图显示了酵母双杂交系统原理。DNA结合结构域转录激活结构域活性转录因子ABC2酵母双杂交的组成酵母双杂交系统由三个部分组成：BD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称诱饵蛋白（bait）；AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称为靶蛋白（prey）；有一个或多个报告基因的宿主菌株。3应用酵母双杂交技术主要应用在以下几方面：检验一对功能已知蛋白间的相互作用；研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域；用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径；分析新基因的生物学功能。第三节表面展示技术运用DNA重组技术在噬菌体、细菌、真菌、病毒等微生物表面呈现外源蛋白或多肽，已在微生物学、分子生物学、疫苗学和生物技术等方面得到了广泛应用。概念表面展示技术是利用基因工程手段将外源基因或一组一定长度的随机寡核苷酸片段克隆到特定的表达载体中，使其表达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面。一、噬菌体展示技术噬菌体展示技术（phagedisplaytechniques，PDT）是将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术（如右图所示）。1985年Smith等首次应用了该技术。1原理具体来讲噬菌体展示技术就是将待筛选基因插入噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因（主要是基因Ⅷ或基因Ⅲ）之间，构成融合蛋白噬菌体库。表达的融合蛋白可以呈现在噬菌体表面，但不影响噬菌体的完整性和活性。噬菌体展示载体pCANTAB5E示意图利用噬菌体展示技术筛选利用展示的多肽与目标蛋白或肽的亲和结合的性质，可高效率的筛选所需基因。过程如图所示，这样一个吸附-洗涤-洗脱-繁殖的富集过程称为淘洗（panning）。结合洗涤洗脱扩增噬菌体展示技术筛选原理噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高通量筛选的方法。其建立基于三个原则：在衣壳蛋白基因（主要是基因Ⅷ或基因Ⅲ）的N端插入外源基因，形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面，不影响也不干扰噬菌体的生活周期，同时保持了外源蛋白的天然构象，并能被相应的抗体或受体所识别。利用固定于固相支持物的靶分子，采用适当的筛选方法，洗去非特异结合的噬菌体，筛选出目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过分泌型噬菌体的单链DNA测序推导出